福爾馬林固定石蠟包埋樣本提取的RNA質量分析及其臨床應用

薛洋，曾富春，舒駿，叢偉

(四川省人民醫院胸外科，四川 成都610072)

福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)組織是目前國內外運用最為廣泛的組織保存形式。因為其能夠保持組織的特殊形態，而且保存時間較長，能夠適合后期的免疫組化和組織學分析，為臨床治療的選擇提供可靠的保障。

目前，分子靶向治療逐步成為腫瘤治療的主流，在臨床用藥前對患者基因突變狀態進行檢測，可正確指導臨床個體化用藥，減輕患者經濟負擔，提高分子靶向藥物治療效果。因此，從FFPE樣本中提取高質量的DNA/RNA進行分子靶標檢測也逐漸受到關注。從FFPE中提取到能夠有效擴增的DNA/RNA不僅適用于回顧性研究，也對疾病的診斷與鑒別、評估疾病預后和探索疾病分子機制具有重要意義[1]。

但是DNA/RNA在福爾馬林固定和石蠟包埋的過程中，都有不同程度的片段化，而且樣本大小、固定時間、固定溫度和包埋條件等等都對DNA/RNA的質量產生極大的影響。近年來，研究人員試圖了解在FFPE樣本制備過程中存在著的各種對DNA/RNA的不利因素，找出解決方案，力求提取出高質量的DNA/RNA，用于后續的基因突變分析，還原樣本真實的基因信息，以提高FFPE樣本在疾病的診斷和預后中的應用價值。

在2011年發表的《中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識》中，對FFPE樣本的處理提出了規范化操作流程，使得各大醫院能輕松地完成從FFPE樣本中提取到高質量的DNA，用于表皮細胞生長因子受體(EGFR)的基因突變檢測，為非小細胞肺癌的靶向治療提供了重要的臨床依據。但是由于環境中存在較多且穩定的RNA酶，導致從FFPE樣本中提取完整的RNA較為困難。隨著技術的不斷完善，國內外出現了許多不同的提取方法，所得RNA的產量及擴增效率也存在著很大差異[2-4]。因此，目前存在著很多質疑：能否從FFPE樣本中提取到高質量并且足夠多的RNA用于后續的基因突變檢測？

目前尚無文獻報道對國內大隊列的FFPE樣本提取的RNA質量進行分析。因此，本研究從國內不同地區收集了994例FFPE樣本，采用廈門艾德生物醫藥科技有限公司生產的FFPE樣品RNA分離試劑盒(2013年獲CFDA批準上市)進行RNA分離，對RNA質量進行分析，并將提取的RNA用于EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測，通過對比測序結果，以此判斷采用FFPE樣本RNA進行基因突變檢測的可靠性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 收集2010年1月至2013年12月共994例FFPE樣本，其中四川省人民醫院303例、上海市某醫院389例、福建省某醫院302例，所有樣本均有明確的病理診斷結果，并根據地區來源和不同年限進行分類，每例患者的組織蠟塊連續切2張5μm厚的切片。

1.2 試劑 FFPE樣品RNA分離試劑盒 (廈門艾德生物醫藥科技有限公司，貨號：ADx-FF04，簡稱AmoyDx RNA試劑盒)；人類EML4-ALK基因融合檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技有限公司)；人類ROS1基因融合檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技有限公司)。

1.2 方法

1.2 .1 FFPE樣本的RNA分離 采用AmoyDx RNA試劑盒進行RNA抽提。(1)切片：一次性切片刀，連續5μm厚切片，每個蠟塊取2個切片，置入1個1.5ml EP管內，4℃冰箱保存；(2)脫蠟：分析純二甲苯浸沒組織切片，渦旋混勻促使組織溶解，離心棄上清；(3)脫二甲苯：加入無水乙醇以去除二甲苯，離心棄上清；(4)干燥；組織沉淀物經干燥蒸發殘留的乙醇；(5)蛋白消化：蛋白酶K及其緩沖液浸沒組織 ，56℃消 化 15min，80℃ 孵 育 15min；(6)DNA 降解：加入DNaseⅠ及其緩沖液，吹打混勻后靜置15min；(7)RNA吸附：加入結合緩沖液，用吸附柱吸附RNA；(8)RNA收集：洗滌兩次吸附柱，空管離心14000r/min 5min； 加入 80μl RNase-freeWater，靜置3min；14000r/min離心1min。RNA樣本立即保存于-80℃冰箱中。

1.2 .2 RNA的質量檢測 使用Thermo Scientific公司的NanoDrop 1000超微量分光光度計檢測核酸的純度和濃度。A260的數值即OD值作為核酸濃度的指標，濃度以ng/μl為單位。A260/A280和A260/A230的比值作為核酸純度的指標。

取5μlAmoyDx RNA試劑盒提取的RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，以鑒定RNA的完整性。取6μl RNA用于HPRT1基因檢測，用于評估RNA樣本中能進行有效擴增的片段含量。

1.2 .3 qRT-PCR 將所提取的RNA進行逆轉錄。采用Takara公司逆轉錄試劑盒進行cDNA合成。25μl逆轉錄體系包含：6μl RNA，5.0μl 5×逆轉錄緩沖液，1μl M-MLV 逆轉錄酶(200U/μl)，3.5 pmol/l特異性逆轉錄引物。反應程序為：42℃60min；95℃5min。分別取5μl逆轉錄產物進行HPRT1基因、EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測。40μl反應體系含有5μl cDNA，0.2mmol/L dNTPs，引物濃度為 0.4μmol/L，1 U ExTaq DNA聚合酶(Takara公司)，4.0μl10×PCR 緩沖液。反應程序為：95℃預變性 5min，15個循環的 95℃變性 25s，64℃退火 20s，72℃延伸20s，接著31個循環的 93℃變性 25s，60℃退火 35s(收集 FAM 和 HEX信號)，72℃延伸20s。實時熒光定量PCR儀機型為Stratagene Mx3000PTM。

1.2 .4 Sanger測序 所提取的RNA樣本先進行逆轉錄及RT-PCR，然后將得到的PCR產物送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

對于EML4-ALK基因融合陽性和ROS1基因融合陽性的RNA樣本，根據已有報道的基因融合序列設計引物進行擴增；對于EML4-ALK基因融合陰性和ROS1基因融合陰性的RNA樣本，則根據EML4-ALK基因和ROS1基因斷裂點處的序列設計引物進行擴增。

1.3 統計學分析 將所提RNA進行EML4-ALK和ROS1基因融合檢測，同時使用Sanger測序法進行驗證，采用χ2檢驗分析其一致性。采用SPSS17.0統計分析軟件進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA純度 對本實驗所得的RNA純度進行檢測：A260/A280(圖 1)和 A260/A230(圖 2)，RNA 的A260/A280和A260/A230均值分別為1.97和1.92。

圖1 RNA A260/A280

圖2 RNA A260/A230

2.2 RNA濃度 對本實驗所得的RNA濃度進行檢測。RNA的濃度和HPRT1的qRT-PCR檢測的Ct均值分別為 204.23ng/μl(圖 3)和 14.09(圖 4)。

圖3 RNA濃度

圖4 RNA HPRT1 Ct值

2.3 RNA完整性 對本實驗所得的RNA的完整性進行檢測。FFPE樣本的RNA電泳多數呈寬帶狀、彌散分布的smear帶，提示降解明顯，平均長度集中在200bp左右。

2.3 .1 比較不同地區來源的FFPE樣本提取的RNA質量 分別對各家醫院的樣本RNA質量進行評估(圖5)。結果顯示：四川省人民醫院樣本RNA的 A260/A280、A260/A230、濃度和 HPRT1 的 Ct均值分別為 2.02、1.98、196ng/μl和 12.0。 上海市某醫院的FFPE樣本RNA的A260/A280和A260/A230均值分別為1.94和1.84， 平均濃度為248ng/μl， 經qRT-PCR檢測的HPRT1的Ct值為14.8，其中有兩例標本沒有檢測到HPRT1的Ct值，標本檢測失敗。福建省某 醫 院 樣 本 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1 的 Ct 均 值 分 別 為 1.96、1.98、156ng/μl、15.3。

圖5 不同地區來源的FFPE樣本的RNA質量比較

2.3 .2比較不同保存年限的FFPE樣本的RNA質量 收集2010~2013年四川省人民醫院的FFPE樣本，其中2010年23例，2011年75例，2012年110例，2013年95例。對上述FFPE樣本進行RNA抽提，并對所獲得RNA的質量進行檢測(圖6)。

2010 年的FFPE樣本提取的RNA的A260/A280、A260/A230、濃度和 HPRT1的 Ct均值分別為1.97、2.03、146 ng/μl、12.8；2011 年的 FFPE 樣本提取的RNA 的 A260/A280、A260/A230、 濃度和 HPRT1的 Ct值分別為 2.02、2.01、169ng/μl、12.6；2012 年的 FFPE樣 本 提 取 的 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1 的 Ct 均 值 分 別 為 2.03、1.98、226ng/μl、12.4；2013年的 FFPE樣本提取的 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃度和 HPRT1的 Ct均值分別為2.04、1.94、195ng/μl、10.9。

圖6 不同保存年限的FFPE樣本的RNA質量比較

2.4 EML4-ALK和ROS1基因融合檢測與Sanger測序結果的對比 人類EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測試劑盒與Sanger測序法均得到檢測結果的FFPE樣本為992例，檢測成功率為99.80%(992/994)。兩種方法檢測結果均為EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合陽性的樣本數為117例，總檢出率為11.79%(117/992)。兩種方法檢測結果均為EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合陰性的樣本數為875例(表1)。

表1 試劑盒法和Sanger測序法對臨床樣本的檢測結果對比情況

根據表1所列檢測數據，兩種方法對992例臨床FFPE樣本的檢測結果的符合率為：

①兩種方法檢測的基因融合陽性符合率為a/(a＋c)=100%。

②兩種方法檢測的基因融合陰性符合率為d/(b＋d)=100%。

③兩種檢測方法檢測結果的總符合率為 (a＋d)/(a＋b＋c＋d)=100%。

即使用人類EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測試劑盒的檢測結果與Sanger測序法完全一致。

3 討論

FFPE樣本具有來源充足、疾病種類廣闊、疾病信息豐富和監控腫瘤性疾病的長期臨床處理過程以及可長期保存、原位診斷和隨時獲取等[5]諸多優點，顯示了其在疾病研究中的巨大潛力。因此，從FFPE中獲取高質量的RNA，對疾病尤其是腫瘤的研究和臨床用藥治療[6-8]具有重要的意義。

RNA樣本的質量檢測一般分為總量、純度與完整性三大項。其中總量可以通過微量分光光度計測定260nm吸收值進行計算。純度可以通過微量分光光度計測定A260/A230的比值，用于評估有機溶劑殘留，理想值應當≥1.8，如果比值低于1.8，則表明存在有機物/鹽離子等污染；測定A260/A280吸收值的比值可用于評估蛋白質污染比例，理想值應為1.9-2.1，如果比值低于1.8，則表明存在蛋白污染。完整性可以通過電泳，目測有無基因組DNA污染，有無RNA降解(28S，18S條帶)[9]。研究表明，每個樣本的Ct值與該樣本的特定基因的起始拷貝數存在一定關系[10]，起始拷貝數越多，Ct值越小。因此，只要比較不同樣本的Ct值，即可推斷出樣本中含有特定基因的起始拷貝數的多寡。由于HPRT1是一種管家基因，在不同來源的細胞中的表達比較穩定，因此可以通過比較RNA樣本中HPRT1的qRT-PCR的Ct值，來判斷樣本中的可擴增片段的濃度。基于上述指標，本文總共對994例FFPE樣本采用AmoyDx RNA試劑盒進行RNA抽提 ，RNA 的 質 量 通 過 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1的qRT-PCR的Ct值來檢測。

各家醫院對于樣本的處理有所不同，包括樣本離體時間、固定時間和溫度、包埋時間和溫度、FFPE組織保存時間和溫度等。而上述條件均會導致FFPE樣本中RNA的片段化程度不同。本文從三個不同地區的三家醫院收集FFPE樣本，均采用AmoyDx RNA試劑盒提取RNA，并對RNA的質量進行檢測分析。從上述結果可以看出：所提取的RNA的A260/A280和A260/A230數值均大于1.8，說明該RNA試劑盒能去除多余的蛋白質和鹽離子，獲得的RNA純度較好。在后續的qRT-PCR反應中，三家醫院的RNA樣本都能進行有效擴增，尤其是四川省人民醫院的RNA樣本的有效擴增片段顯著多于其它兩家醫院，說明采用RNA試劑盒法從這三家醫院的FFPE樣本提取的RNA，在純度和總得率上均能適用于qRT-PCR的基因突變檢測。

Nam等人[11]評估了樣本的儲存時間對RNA抽提質量的影響。將FFPE樣本儲存在室溫1個月至10年。結果顯示儲存時間越長，RNA得率越低，純度也顯著降低。儲存3~8年的樣本中有58.3%能檢測出β-actin的表達，儲存1個月至1年的樣本有62.5%能檢測出β-actin的表達，儲存時間少于1個月的樣本全部能檢測出β-actin的表達。本研究對樣本的保存年限進行分組，考察RNA試劑盒提取的RNA的質量。結果顯示，不同保存年限的FFPE樣本，所提取的RNA的純度均能符合要求，即A260/A280和A260/A230大于1.8，而在RNA得率方面，2012和2013年的FFPE樣本的RNA濃度高于2010和2011年，而且有效片段濃度也高于后者，說明FFPE樣本保存年限越長，RNA降解程度越大。

EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合各自分別代表了一類具有特定臨床與病理特征的NSCLC分子亞群。文獻報道約3%~7%的NSCLC存在EML4-ALK基因融合[12-15]，另有約1%-3%的NSCLC存在ROS1基因融合[16,17]，從而為肺癌的治療提供了新的分子靶點。現有臨床研究表明，以EML4-ALK基因融合、ROS1基因融合為靶點的新型EML4-ALK/ROS1酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼對攜帶EML4-ALK基因融合或ROS1基因融合的NSCLC患者療效顯著，其客觀緩解率(ORR)分別為57%和54%，疾病控制率(DCR)則分別達到了87%和85%[18,19]。因此，準確檢測EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合存在狀態，可為腫瘤患者的靶向用藥治療提供必要依據。本研究檢測的EML4-ALK和ROS1融合基因陽性率為11.77%，與上述報道數據一致，而且檢測結果與Sanger測序法的陽性檢出率、陰性檢出率均為100%，說明從FFPE樣本中提取的RNA，可以用于基因突變檢測，而且檢測結果真實可靠，可為靶向治療方案的選擇提供重要的證據。

994 例FFPE樣本RNA中有992例可用于qRT-PCR的檢測，檢測成功率為99.80%。由于目前各大醫院對樣本的處理進行了規范化操作：控制離體時間，用中性的10%福爾馬林浸泡，根據樣本大小不同來調節固定時間，使得從FFPE樣本中提取出來的RNA質量較好，而且qRT-PCR產物長度較短，低于130bp，這些改善措施大大提高了從FFPE樣本中提取的RNA質量，適合后續的基因突變檢測，使得FFPE樣本的臨床利用率大為提高，能提供真實可靠的基因突變圖譜，可為靶向治療提供可靠的保障。

[1]Klopfleisch R,Weiss AT,Gruber AD.Excavation of a buried treasure-DNA,mRNA,miRNA and protein analysis in formalin fixed,paraffin embedded tissues[J].Histol Histopathol,2011,26(6):797-810.

[2]Fedorowicz G,Guerrero S,Wu TD,et al.Microarray analysis of RNA extracted from formalin-fixed,paraffin-embedded and matched fresh-frozen ovarian adenocarcinomas[J].BMC Med Genomics,2009,2:23-35.

[3]Takano EA,Mikeska T,Dobrovic A,et al.A multiplex endpoint RT-PCR assay for quality assessment of RNA extracted from formalin-fixed paraffin-embedded tissue[J].BMC Biotechnology,2010,10:89-102.

[4]Waddell N,Cocciardi S,Johnson J,et al.Gene expression profiling of formalin-fixed,paraffin-embedded familial breast tumours using thewhole genome-DASL assay.JPathol,2010,221(4):452-461.

[5]Osawa S,Shimada Y,Sekine S,et al.MicroRNA profiling of gastric cancer patients from formalin-fixed paraffin-embedded samples[J].Oncol Lett,2011,2(4):613-9.

[6]中國臨床腫瘤學會腫瘤生物標志物專家委員會.中國間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽性非小細胞肺癌診斷專家共識(2013版)[J].中華病理學雜志,2013,42(6):402-406.

[7]中華醫學會呼吸病學分會肺癌學組 中國肺癌防治聯盟.晚期非小細胞肺癌分子靶向治療專家共識(2013版)[J].中華結核和呼吸雜志,2014,37(3):177-183.

[8]中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家組.中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識[J].中華病理學雜志,2011,40(10):700-702.

[9]Eldh M,Latvall J,Malmholl C,et al.Importance of RNA isolation methods for analysis of exosomal RNA:evaluation of different methods[J].Mol Immunol,2012,50(4):278-286.

[10]Kreth S,Heyn J,Grau S,et al.Identification of valid endogenous control genes for determining gene expression in human glioma[J].Neuro Oncol,2010,12:570-579.

[11]Nam SK，Im J.Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation[J].Korean JPathol.,2014,48(1):36-42.

[12]Soda M,Choi YL,Enomoto M,et al.Identification of the transforming EML4-EML4-ALK fusion gene in non-small cell lung cancer[J].Nature,2007,448(7153):561-566.

[13]Kwak E,Bang YJ,Camidge R,et al.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small cell lung cancer[J].N Engl JMed,2010,363(18):1693-1703.

[14]Kim H,Yoo SB,Choe JY,et al.Detection of ALK gene rearrangement in non-small cell lung cancer:a comparison of fluorescence in situ hybridization and chromogenic in situ hybridization with correlation of ALK protein expression[J].JThorac Oncol,2011,6(8):1359-1366.

[15]Paik JH,Choe G,Kim H,et al.Screening of anaplastic lymphoma kinase rearrangement by immunohistochemistry in non-small cell lung cancer:correlation with fluorescence in situ hybridization[J].J Thorac Oncol,2011,6(3):466-472.

[16]Bergethon K,Shaw AT,Ou SH,et al.ROS1 rearrangements define a uniquemolecular class of lung cancers[J].JClin Oncol,2012,30(8):863-870.

[17]Davies KD.Identifying and targeting ROS1 gene fusions in nonsmall cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2012,18(17):4570-4579.

[18]Camidge DR,Bang Y,Kwak EL,et al.Progression-Free Survival(PFS)from a Phase 1 Study of Crizotinib (PF-02341066)in Patients with EML4-ALK-Positive Non-Small Cell Lung Cancer(NSCLC)[R].Chicago:the ASCO Annual Meeting,2011.

[19]Shaw AT,Yeap BY,Solomon BJ,et al.Effect of crizotinib on overall survival in patients with advanced non-small-cell lung cancer harbouring EML4-ALK gene rearrangement:a retrospective analysis[J].Lancet Oncol,2011,12(11):1004-1012.