骨髓增生異常綜合征患者循環m icroRNA-144的檢測及其臨床意義

饒燕飛 ，劉靜 ，章海斌 ，姚心韻 ，丁偉榮

(1、南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006；2、四川大學華西口腔醫學院2010級，四川 成都 610041；3、江西省人民醫院血液科，江西 南昌330006)

骨髓增生異常綜合征 (myelodysplastic syndromes，MDS)是一組異質性克隆性造血干細胞疾病，表現為難治性的一系或多系血細胞減少，因其具有高風險向急性白血病轉化的特征而嚴重危害人們的生命健康。臨床上，MDS的診斷分型與預后判斷主要基于病理學和細胞遺傳學特征，如骨髓原始細胞數、染色體組型和外周血細胞減少程度等。最近研究發現，MDS患者外周血循環microRNAs對疾病的診斷和預后亦有良好鑒別效果，尤其是在預后判斷方面，let-7a和miRNA-16的準確性已超過常用預后評分系統[1]。

近年研究證實，miRNA-144在造血系統中發揮了重要的調控作用，參與紅系細胞的分化調節[2]，促進慢性髓系白血病的發生發展[3]，影響急性髓系白血病預后[4]。但其與造血系統異常的MDS的相關性尚無相關研究提及，本研究將就miRNA-144在MDS中的表達情況及其臨床意義做一初步探討。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集南昌大學第二附屬醫院2011年3月至2013年12月間確診的MDS患者，分型標準參照世界衛生組織(TheWorld Health Organization,WHO)2008年分型診斷標準。共納入MDS病例24例，同時收集12例健康志愿者作為對照組。所有研究對象均收集EDTA抗凝全血3ml，離心取血漿備用。納入標準：(1)首次就診，未經任何治療；(2)分別經形態學及病理學確診；(3)未合并其它血液系統疾病。排除標準：(1)診斷或分型不明確者；(2)合并其它嚴重消耗性疾病者。

1.2 microRNA檢測 取500μl血漿，使用Trizol(Invitrogen)提取總RNA，溶解于DEPC處理過的蒸餾水中，檢測OD260/OD280及濃度，取合格樣本應用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA進行qRT-PCR。miRNA-144及U6內參引物序列如下：miRNA-144 正 向 ：5’-GCT GGG ATA TCA TCA TAT ACT G-3’， 反向：5’-CGG ACT AGT ACA TCA TCT ATA CTG-3’；U6 正 向 ：5’-CTC GCT TCG GCA GCA-3’；反向：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。 QRT-PCR反應 在 ABI7500 PCR儀上進行，反應體系為20μl，含cDNA 1μl，Takara SYBR Green IMastermix(2×)12.5μl， 引物各0.5μl，ROX Reference Dye(50×)0.4μl，dH2O 5.1μl。反應條件為：95℃變性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環。反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線，以U6表達量為內參照標準，根據雙Delta法[5]計算miRNA-144的相對表達量，計算公式為：

(1)基因相對表達量=2-ΔΔCt；

(2)ΔΔCt=(CtmiRNA-CtU6)MDS-(CtmiRNA-CtU6)control。

1.3 統計分析 qRT-PCR每次測定均設置3個復孔，結果以均數±標準差(x±s)表示，以 REST 2009軟件輔助分析。兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，統計分析應用SPSS v19.0完成。

2 結果

2.1 病例特征 對照組為12例健康體檢者，其中男、女各6例，年齡20~70歲，中位年齡52歲。納入的24例MDS患者男13例，女11例，年齡31~79歲，中位年齡64.5歲，其余臨床特征見表1。

表1 24例MDS病例資料

2.2 miRNA-144在MDS中的表達 根據雙Delta法計算miRNA-144的相對表達量 (即MDS中miRNA-144表達量相對于對照組miRNA-144表達量的倍數)，健康對照組表達量為1，MDS組相對表達量為 5.07±2.38，MDS各亞組表達量見圖 1，RCUD、RCMD、RARS、RAEB-1 及 RAEB-2 各 組miRNA-144的相對表達量分別為3.81±1.46、3.64±1.30、4.56±0.18、6.49±2.01 及 8.73±2.80， 均顯著高于健康對照組，P＜0.01。

圖1 MDS中m iRNA-144的相對表達量

2.3 miRNA-144與MDS預后 依據MDS的WHO分型預后積分系統(WPSS)，本研究將MDS類型歸為預后好類，包括RCUD、RCMD和RARS型，和預后差類，包括RAEB-1和RAEB-2型。miRNA-144在預后好和預后差組中的相對表達量分別為3.81±1.23和7.18±2.38，差異具有統計學意義，P<0.01，結果見圖 2。

圖2 m iRNA-144相對表達量與MDS預后相關

3 討論

miRNA是廣泛存在于動植物中的一類內源性小分子單鏈非編碼RNA，其通過整合入基因沉默復合物(RNA induced silencing complex，RISC)特異性識別和結合目的mRNA的3′端非編碼區或者直接降解mRNA而抑制靶mRNA的翻譯，調控基因的表達，miRNA認為是基因表達轉錄后微調節的重要機制，其在細胞增殖、分化和死亡中起重要作用，并參與生物學進程的所有方面[6]。

MDS的發病機制十分復雜，涉及遺傳不穩定性、造血干祖細胞功能異常、免疫監視功能受損和骨髓微環境異常等。目前，眾多研究已經證明microRNAs與血細胞的增殖分化[7]及MDS的發生發展密切相關，且在不同類型和危險度的MDS患者體內呈特征性表達[8,9]。我們的研究顯示，miRNA-144在MDS中的表達量顯著高于正常對照組，且分類統計顯示，所有類型MDS的miRNA-144的升高均有統計學意義，說明miRNA-144升高在MDS中具有一定的普遍性，這提示我們，miRNA-144與MDS具有一定相關性。查閱文獻發現，miRNA-144能調節早期紅細胞的成熟和增生，敲除miRNA-144能顯著降低紅系細胞的分化成熟能力，并且miRNA-144在應激條件下調節基因表達對于穩定紅細胞生成至關重要[2，10]，由此我們推測，MDS中miRNA-144的高表達狀態很可能是紅系代償性增生的結果，當然，鑒于miRNAs靶基因的多樣性及其功能的復雜性，miRNA-144在MDS中的高表達可能還有其它原因，這有待于進一步研究證實。

另一方面，我們的研究顯示，在MDS亞型RAEB-1和RAEB-2中，miRNA-144的升高程度顯著高于 RCUD、RCMD和 RARS亞型。根據WPSS預后評分系統，RAEB-1和RAEB-2屬于高危因素，而RCUD、RCMD和RARS相對屬于低危因素，這提示我們，miRNA-144的表達量可能有助于MDS的預后判斷。目前，miRNAs作為新興的疾病診斷、預后分子標志物已得到大量研究證實[11-15]，其中let-7a和miRNA-16已被證實當其用于MDS預后評估時，其準確性已超過常用預后評分系統[1]。鑒于此，我們將繼續研究miRNA-144對MDS的預后判斷能力，以期發現新的MDS預后評估分子標志物。

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