絲孢酵母菌屬顯色鑒定的研究

廖晚珍，曾令兵，孫愛娣，彭衛(wèi)華，胡雪飛，胡妮婭

(南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006)

近年來，由于廣譜抗菌藥物、皮質激素、免疫抑制劑等廣泛應用，各種侵入性操作的開展，全身和局部抵抗力低下導致免疫損害的患者由阿薩希絲孢酵母菌引起的感染越來越多，而且臨床常常難以作出及時、準確的診斷，往往錯過最佳的治療時機，導致很高的死亡率。發(fā)生這種情況的主要原因是臨床醫(yī)師和微生物學檢驗人員對其缺乏認識，而往往存在誤檢和漏檢。對于阿薩希絲孢酵母菌及同屬其他種的表型檢測，目前醫(yī)院只能采用BIOMERIEUX VITEK-2-Compact和ATB-ID-32C系統(tǒng)以及API 20C AUX系統(tǒng)，但上述方法不僅受到條件的限制，而且費時、費力、費成本，不適合基層醫(yī)院的常規(guī)檢測。因此，尋找一種鑒定時間更短、鑒定成本更低、操作更簡便、敏感性和特異性較好的方法，成為當務之急。近幾年來，我們對臨床分離的阿薩希絲孢酵母菌與標準菌株及同屬其他標準菌株以及念珠菌的標準菌株與臨床菌株進行了顯色鑒定的研究，同時并經(jīng)菌落與菌體形態(tài)、生化特性等確認，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1 菌株來源 收集南昌大學第一附屬醫(yī)院2009年1月至2010年11月30日臨床分離的阿薩希絲孢酵母菌18株，6株絲孢酵母菌標準菌株(購于 American type culture Collection-ATCC)，即阿薩希絲孢酵母菌(T.asahii，ATCC 90039)；倒卵絲孢酵母菌(T.ovoides，ATCC 90040)；黏質絲孢酵母菌(T.mucoides，ATCC 90046)；暗紅或皮瘤或墨(汁)絲孢酵母菌(T.inkin，ATCC 18020)；皮狀絲孢酵母菌 (T.cutanceum，ATCC 757)；星狀絲孢酵母菌(T.asteroides，ATCC 22432)以及本室保存的念珠菌38株，包括克柔念珠菌 (ATCC 6258)，新型隱球菌(ATCC 32609)，季也蒙念珠菌(ATCC 21500)，葡萄牙念珠菌 (ATCC 34449)，光滑念珠菌(ATCC 22019)，熱帶念珠菌(ATCC 1463)，白念珠菌(ATCC 90029)等。

1.1 .2顯色培養(yǎng)基與儀器 科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基由河南鄭州博賽生物技術股份有限公司提供。絲孢酵母菌與念珠菌鑒定儀器為BIOMERIEUXVITEK-2-Compact。

1.1 .3藥敏試驗培養(yǎng)基及藥敏紙片 真菌藥敏瓊脂LS 1940A，LOT SHAD-130201。抗菌藥片為丹麥ROSCO公司產品，包括兩性霉素B(AMPHO、10μg/片)，特比奈芬(TEB、30μg/片)，氟康唑(FLZ、25μg/片)，氟胞嘧啶(FLU、1μg/片)，卡泊芬凈(CASP、5μg/片)，沃爾康唑(VOR、1μg/片)，伊曲康唑(ITR、10μg/片)，藥片直徑9.2mm。

1.2 方法

1.2 .1顯色培養(yǎng) 挑取薩布羅瓊脂(SDA)T.asahii標準菌株與臨床菌株和絲孢酵母菌的其他5個標準菌株以及念珠菌標準菌株與臨床菌株的單個菌落密集接種科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，置35℃(濕度約50%)空氣培養(yǎng) (絲孢酵母菌加做28℃顯色培養(yǎng))，次日觀察并記錄結果。

1.2 .2菌落菌體形態(tài)檢測 挑取T.asahii標準菌株與臨床菌株以及絲孢酵母菌的其他5個標準菌株單個菌落點種SDA，置35℃空氣培養(yǎng)，每天觀察生長情況，并涂片、染色、鏡檢與拍照等。

1.2 .3生化鑒定 挑取35℃SDA上孵育18~72h的T.asahii標準菌株與臨床菌株、T.inkin與T.mucoides標準菌株和念珠菌標準菌株與臨床菌株，將菌液濃度調至1.8~2.2MCF，再接種YST卡經(jīng)BIOMERIEUX-VITEK-2-Compact進行菌株鑒定。1.2.4 藥敏檢測 調節(jié)菌液濃度為5×105CFU/ml，接種前平皿置35℃干燥20min，9cm平皿吸0.5ml接種液，傾注平板表面，均勻涂布，并放置室溫干燥10min貼藥片(也可按K-B法用棉拭子涂布)。然后置35℃培養(yǎng)18~24h測量抑菌圈。對過夜培養(yǎng)真菌不生長者應延長24h。對多烯類藥物和氟胞嘧啶測量時應為清晰的抑菌圈，若抑菌圈內有菌落應視為耐藥突變株。對于吡咯類、咪唑類及特比奈芬抑菌圈內的小菌落可不視為突變株。采用白念珠菌(ATCC 90028)、近平滑念珠菌(ATCC 22019)、克柔念珠菌(ATCC 6258)進行質控。

2 結果

2.1 菌落特征

2.1 .1 SDA菌落特征 T.asahii標準菌株與臨床菌株以及絲孢酵母菌的其他5個標準菌株在35℃時菌落呈中等速度生長(比念珠菌生長慢)。念珠菌菌落呈灰白色、隆起、細膩、光亮、似奶油狀，菌落周邊與中央無區(qū)別。而T.asahii菌落呈灰色、表面粗糙、邊緣菲薄、而且越靠近菌落邊緣越薄、顏色越淺，菌落中心為白色，而且越靠近中央顏色越明顯，并呈乳頭狀凸起，且有短小的細絨毛形成(見圖1)。隨著培養(yǎng)時間延長菌落邊緣凸起呈花邊狀，表面有寬而深的樹根狀或腦回狀裂隙，即帶有不規(guī)則放射狀排列的皺褶(見圖2)。T.mucoides菌落潮濕、邊緣整齊、毛狀不明顯、白色、腦回樣、隆起并折疊、有的呈鈕扣狀。而T.inkin菌落局限，即薄而扁、干燥、易推動，白色、細的腦回樣覆蓋有小顆粒，表面有不規(guī)則花邊狀物凸起，沒有邊界帶，常嵌入瓊脂，“花邊狀物”凸起是該菌最為明顯的特征。T.ovoides呈灰白色、菌落明顯凸起、邊緣不齊、常嵌入瓊脂，表面可見細絨毛，菌落周邊顏色稍淡。T.cutanceum和T.asteroides，前者與T.asahii基本相似，其最大特點是，菌落與瓊脂結合得特別緊密，很難刮取，其它5個標準菌株和T.asahii臨床菌株沒有此現(xiàn)象，后者與其他種比較無特殊。

2.1 .2 顯 色 培 養(yǎng) 基 菌 落 特 征 T.asahii，T.cutanceum，T.inkin，T.ovoides，T.asteroides在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板的背面明顯呈天藍色 (或稱藍綠色，見圖3)，在正面呈灰白色(見圖4)，而所有念珠菌、隱球菌、紅酵母等不顯這種天藍色，而且正反面顯色一致，如熱帶念珠菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基

注：T.asahii SDA 2～3d菌落呈灰色、表面粗糙、邊緣菲薄、中央顯白色、并呈乳頭狀凸起、且有短小的細絨毛。

圖2 T.asahii22℃SDA菌落生長特征

圖3 T.asahii在念珠菌顯色培養(yǎng)基背面的顯色特點

圖4 T.asahii在念珠菌顯色培養(yǎng)基正面的顯色特點

圖5 熱帶念珠菌的顯色特點

中顯鐵藍色(見圖5),這是上述5種絲孢酵母菌與其他酵母(樣)真菌的明顯不同之處。其次，用接種環(huán)或棉拭子等刮去瓊脂上的菌落時，培養(yǎng)基仍然存在明顯的天藍色，而念珠菌等沒有這種現(xiàn)象，即菌落下面(顯色平板表面)不會留下任何顏色，這說明上述5種絲孢酵母菌所產生的色素具有向念珠菌顯色培養(yǎng)基中滲透的能力，而念珠菌等沒有色素滲透或侵入生長的能力，這種獨特的現(xiàn)象又可作為鑒別的一項指標。6個標準菌株中只有T.mucoides不顯這種藍色，但也不顯其它顏色，保持其灰色。綜上所述，只要在念珠菌顯色培養(yǎng)基上顯天藍色的酵母(樣)菌即可確定為絲孢酵母菌，且臨床標本中，若出現(xiàn)該現(xiàn)象，95%以上可確定為T.asahii。

2.2 光學顯微特征 生理鹽水涂片時，T.asahii及同屬其他種菌很難乳化，菌懸液呈顆粒狀，而念珠菌、隱球菌等菌極易乳化，菌懸液均勻。T.asahii鏡檢時有菌絲、關節(jié)孢子和多形態(tài)分生孢子。菌絲分隔，大多數(shù)不分枝、粗細不一。關節(jié)孢子數(shù)目不等、長短不一、兩端鈍圓并呈竹節(jié)狀。T.mucoides的關節(jié)孢子也呈竹節(jié)狀，但該菌在顯色培養(yǎng)基上不顯藍色，此可作為兩者的鑒別點。而T.inkin、T.cutanceum，T.ovoides，T.asteroides的關節(jié)孢子呈柱狀，分生孢子呈圓形或橢圓形，少數(shù)呈長方形，出芽或不出芽，可見頂生、間生或游離型厚壁孢子。菌絲和孢子總的來看形態(tài)不規(guī)則，而念珠菌多數(shù)是孢子、少數(shù)為菌絲，孢子絕大多數(shù)呈圓形或橢圓形，大小基本一致，并可見較多的芽生孢子。

2.3 生化特征18株T.asahii臨床菌株與標準菌株其生化鑒定率90%~99%。T.inkin與T.mucoides標準菌株的鑒定率分別為97%與99%。38株顯其它顏色的酵母(樣)菌鑒定率均大于85%。

2.4 藥敏試驗結果 采用 TEB、CASP、FLZ、VOR、AMPHO、ITR、FLU藥片對絲孢酵母菌6株標準菌株和T.asahii所有臨床菌株進行體外敏感性試驗，其檢測結果是：6株標準菌株和18株臨床菌株對VOR、AMPHO均敏感。標準菌株和部分臨床菌株對FLZ和ITR敏感，大部分為中介，個別菌株對ITR耐藥。除少數(shù)標準菌株對TEB敏感外，多數(shù)標準菌株和所有臨床菌株對TEB均為中介，個別菌株出現(xiàn)耐藥。所有絲孢酵母菌標準菌株和不同來源的臨床菌株對FLU和CASP均耐藥，而T.asahii所有菌株對兩性霉素B的活性比較差、且不穩(wěn)定、波動范圍大，MIC值在0.75~>32μg/ml，其中9株>32μg/ml，75%為耐藥；2 株 1.0μg/ml，1 株 0.75μg/m l，此結果與擴散法相反。唑類抗真菌藥物對T.asahii所有菌株有較好的活性，又以伏立康唑最敏感，MIC值在0.004~0.125μg/ml；伊曲康唑次之，MIC值在0.19~1.50μg/ml；氟康唑的活性要比前2種差，MIC值絕大部分在0.75~3.00μg/ml，還有來自皮膚標本的菌株MIC值在24μg/ml，高出8倍?？偟膩砜矗Y果與擴散法相似。

3 討論

絲孢酵母菌屬于真菌界、擔子菌門(或亞門，或稱半知菌門或亞門)、芽生菌綱(或芽胞綱、或銀耳綱)、隱球酵母目(或擔孢目或銀耳目)、皮膚絲孢酵母科(或隱球酵母科)、絲孢酵母屬，包括38個種，其中13個種可引起人類感染[2]。最近的系統(tǒng)學研究表明，致病的絲孢酵母菌主要有6個種，即T.asahii、T.asteroides、T.cutanceum、T.inkin、T.mucoides和T.ovoides。其中T.asahii與深部感染有關[3，4]，與我院臨床分離的菌株和感染的情況一致。從現(xiàn)有的臨床資料看，患者有無免疫功能低下都可感染并引起系統(tǒng)播散，但免疫功能低下患者較免疫正常患者更容易引起感染[5，6]。其原因(可能的發(fā)病機制)是，平時宿主局部甚至全身的免疫網(wǎng)絡對這些定植的低等真核生物保持制約和監(jiān)視，將其限制在特定部位并保持較低的載量，一旦免疫系統(tǒng)受損有了機會這些真菌就會啟動菌群密度感應信號和菌相轉換信號，由母細胞多極出芽繁殖，部分出芽細胞不脫落而不斷延長形成菌絲(或假菌絲)，增多的菌體數(shù)量和形成的菌絲需要更多的營養(yǎng)及更寬裕的生存空間，因此就會表達毒力基因產生毒力蛋白，黏附并侵襲附近的宿主黏膜上皮細胞，甚至產生易位效應，由腸道或口咽、食管、陰道等黏膜侵入機體，造成播散性感染[7]。近年來感染有增多傾向，主要有以下三個原因：一是T.asahii等的感染確實在增多，尤其是綜合性醫(yī)院，但過去沒有引起注意。二是由于抗菌藥物在前些年的不合理使用甚至濫用所造成。三是過去無論是臨床醫(yī)生還是微生物學檢驗人員對此菌缺乏認識，加上檢測手段(方法)不多、檢測不到位，誤檢或漏檢可能普遍存在。

以往對T.asahii等的鑒定只能依靠VITEK-2-Compact系統(tǒng)和ATB-ID-32C系統(tǒng)以及API 20C AUX系統(tǒng)或分子生物學，其他型別儀器和方法無法檢出。采用分子生物學檢測T.asahii等(包括測序)，除了需購買一整套試劑外，還需有PCR儀和自動DNA測序儀等高檔設備，而醫(yī)院檢驗科一般都沒有測序儀這種配置。此外，就時間而言，從DNA提取開始到完成測序和比對需要幾天的時間，如果DNA測序要外送的話時間就更長。若采用VITEK-2-Compact系統(tǒng)或ATB-ID-32C系統(tǒng)鑒定T.asahii等，一要時間(需等待真菌對糖的發(fā)酵，碳、氮源的同化，耐溫試驗和外源性維生素依賴檢測等)，二要有這種設備，而國內目前很大一部分醫(yī)院包括三級醫(yī)院不一定有這種配備，由于沒有這種功能儀器根本無法檢測T.asahii。即使采用相對簡單、經(jīng)濟的API 20C AUX系統(tǒng)，也需進口試劑，操作也較繁瑣。

1990 年以來一系列商品化顯色培養(yǎng)基進入臨床微生物實驗室出現(xiàn)了針對越來越多的細菌和真菌的顯色培養(yǎng)基[8]，其中念珠菌顯色培養(yǎng)基就是眾多商品化顯色培養(yǎng)基的一種。在真菌(指酵母菌)培養(yǎng)基中加入檢測某種菌種的特異性酶底物，底物由色基因和微生物可代謝物質組成，通常是無色的，如果標本中(或待測菌培養(yǎng)物)存在該菌及其特有的酶，在酶的作用下產色基因被游離出來，使菌種產生顏色，采用這種方法進行篩選或鑒定，其敏感性和特異性都高?？片敿文钪榫@色培養(yǎng)基多用于常見念珠菌菌的鑒定，在培養(yǎng)基上顯綠色或翠綠色、藍灰色或鐵藍色(見圖5)、紫色、粉紅色的分別是白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌，后兩種菌除顏色外還要根據(jù)菌落的特點來確定。我們注意到，在此培養(yǎng)基上T.asahii呈天藍色，與熱帶念珠菌所顯的鐵藍色(實際上更偏重于灰色)和白念珠菌所顯的綠色存在明顯的差別，兩者在色澤上很好區(qū)分，不會造成顏色分辨上的困難和鑒別上的麻煩。此外，念珠菌與絲孢酵母菌無論在SDA還是念珠菌顯色培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)也不一樣。我們通過在念珠菌顯色培養(yǎng)基上對菌落的顯色，對T.asahii等進行快速、準確的鑒定，不僅縮短了對絲孢酵母菌的鑒定時間，而且操作簡便，敏感性與特異性好，而且涵蓋面廣 (包括T.asahii、T.cutanceum、T.inkin、T.ovoides、T.asteroides5個種)，不需要昂貴的進口設備、耗材與試劑，檢測成本低，而且解決了多年來完全依靠新版API 20C AUX和VITEK-2-Compact系統(tǒng)以及ATB-ID-32C系統(tǒng)表型檢測的難題，極大地方便了各級醫(yī)院的常規(guī)檢測，這對臨床絲孢酵母菌病的及時診斷和患者的早期治療具有非常重要的意義。根據(jù)王端禮的《醫(yī)學真菌學》，播散性絲孢酵母菌病的臨床表現(xiàn)在許多方面與播散性念珠菌病相似，可呈急性或慢性感染過程。因此，診斷與鑒別主要靠真菌學。治療方面，大多數(shù)絲孢酵母菌病患者在抗真菌藥物(如：兩性霉素B及其脂質體、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、特比奈芬等)治療的同時，還應對基礎性疾病和繼發(fā)的細菌感染進行治療，并加強支持療法(如應用免疫調節(jié)劑，提高患者的免疫功能，并注意臟器的保護)。如有肝腎功能情況則改用脂質體兩性霉素B聯(lián)合氟康唑治療。若有明顯肝腎功能損害時，用兩性霉素B脂質體，但治療時間需延長，或單用伏立康唑。非白細胞減少的局限性感染者常用兩性霉素B與其他唑類藥物聯(lián)合治療。白細胞減少者兩性霉素B可能療效欠佳，可采用兩性霉素B與氟康唑或伊曲康唑聯(lián)合治療有效，也有學者提出，T.asalii感染首選伏立康唑，其次是伊曲康唑、氟康唑、脂質體兩性霉素B等，本研究中藥敏試驗結果與該建議一致。臨床在抗感染時應依據(jù)藥敏結果合理使用抗菌藥物。

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