血液腫瘤CD44基因檢測及4亞型克隆原核表達

蔡壬辛 ，洪旭燦 ，張軒 ，李沫 ，秦笙 ，許振杰 ，曾建明

(1、廣東省中醫院檢驗科，廣東 廣州 510006；2、佛山市第二人民醫院檢驗科，廣州 佛山528000)

CD44是廣泛分布于多種細胞表面的糖蛋白分子，屬黏附分子的成員，具有多種重要的生物功能，它與細胞黏附、淋巴細胞活化和歸巢、腫瘤生長和轉移密切相關[1,2]；CD44分子呈廣泛多態性，多態性主要由核心肽的不同及翻譯后的糖基化修飾引起[3]。目前對CD44分子的研究主要集中在實體瘤，相繼發現CD44v6亞型的過度表達與多種人體惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關，被認為是腫瘤轉移促進因子[4-7]。

化療后復發是白血病治療的難點，近十年提出殘留的白血病干細胞(leukemia stem cells,LSCs)是疾病復發的根源。有研究提示拮抗LSCs黏附、歸巢(homing)途徑可能有助于殺滅LSCs[8]。有研究發現CD44單克隆抗體A3D8通過抑制ERK1/2上調Bim誘導HL-60細胞早期凋亡[9]。CD44通過p27Kip1途徑抑制AML細胞增殖[10]。伊馬替尼是治療慢性粒細胞白血病(CML)的一線藥物，它能夠降低JURL-MK1細胞CD44等分子表達，并引起細胞凋亡[11]；現發現伊馬替尼耐藥細胞中CD44亦表達增高[12]，阻斷CD44有益于CML患者自體移植[13,14]。另外，CD44在AML和CML的LSCs細胞龕中發揮重要作用[15]。此外，淋巴瘤CD44高表達患者發生治療不緩解或復發，甚至死亡率更高[16]；小鼠動物實驗也發現BCR-ABL1轉染的CD44缺陷干細胞不能在受體小鼠骨髓歸巢[13]，這提示通過干預CD44途徑實現拮抗殘留的LSCs，有望成為白血病治療新的切入點。

本實驗旨在通過PCR檢測臨床血液腫瘤患者和細胞株CD44分子，并通過基因重組技術構建CD44胞外區(hCD44om)多肽原核表達載體，在大腸埃希菌BL21(DE3)中表達，為下一步研究CD44骨髓靶向功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1 主要試劑 X-gal、IPTG、 氨芐西林鈉(Amp)、低分子質量蛋白標準、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，購自大連寶生物工程有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、低熔點瓊脂糖，購自北京原平皓生物工程公司；限制性內切酶EcoR I、HindⅢ，連接酶，Ex TaqDNA聚合酶為 TakaRa公司產品；Trizol、DNA Marker、質粒抽提和膠回收試劑盒為東盛公司產品，蛋白Marker、異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)為Fermentas公司產品；ECL超敏發光液為北京普利萊公司產品，兔抗人CD44單克隆抗體為美國Abcam公司產品，羊抗兔IgG-HRP為武漢博士德公司產品。

1.1 .2標本 血標本源于廣東省中醫院臨床樣本。9個標本中，4例為急性白血病(AML)，5例為慢性粒細胞白細胞 (CML)；K562、HL-60細胞源于南方醫科大學附屬南方醫院血液科實驗室。

1.1 .3 菌種和質粒 質粒pET32a(+)、大腸埃希菌(E.coli)DH5α為本實驗室保存，BL21(DE3)由東盛生物公司提供。

1.1 .4 PCR引物 根據Genbank基因序列設計引物，由北京華大基因技術有限公司合成。P1：5’-CCGGAATTCATGGACAAGTTTTGGTGGCACG-3’(含 EcoR I 酶切位點)；P2：5’-CGCAAGCTTTTCTGGAATTTGGGGTGTCCT-3’(含 HindⅢ 酶切位點)。

1.2 方法

1.2 .1 cDNA的制備 采用Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，Trizol提取總RNA，-70℃保存備用。參照Invitrogen公司試劑盒（貨號1559026）說明書提取細胞總RNA，按TakaRa試劑盒說明書進行 RT-PCR。 PCR 條件：95℃預變性 5 min；94℃45s、55℃ 40s、72℃延伸 1min，共 30 個循環；72℃延伸10min。

1.2 .2重組質粒pET32-CD44的構建 凝膠回收試劑盒回收PCR產物，經EcoR I、HindⅢ雙酶切后與同樣雙酶切的 pET32a(+)質粒 16℃連接3h，轉化DH5α感受態細胞，涂布于60μg/ml Amp LB平板，培養10～14h后挑選單個菌落，轉移至3ml 60μg/m l Amp LB培養，37℃ 250r/min搖菌培養10~14h，菌液煮沸后PCR鑒定；同時送Invitrogen公司測序鑒定。

1.2 .3 CD44胞外區的誘導表達 將測序鑒定正確的重組表達載體pET32-CD44轉化BL21(DE3)感受態細胞，挑取單個克隆于含60μg/m l Amp LB液體培養基中過夜培養。取60μl過夜培養液菌至3ml 60μg/ml Amp LB，培養至A600值為0.6~0.8時，加入終濃度為 0.2、0.4、0.6和 1.0 mM 的 IPTG，37℃振蕩培養 4h，4℃離心收集菌體，10%SDSPAGE分析；然后以終濃度為1.0 mM的IPTG在37℃誘導2h~5h，再進行SDS-PAGE分析；同時進行30℃誘導表達。以BandScan5.0軟件分析蛋白表達情況。按優化后條件擴大培養，分別取上清及包涵體沉淀進行SDS-PAGE分析蛋白表達情況。以pET28a(+)-GFP為陽性對照，BL21(DE3)菌為陰性對照。

1.2 .4 Western blot細菌裂解產物離心后經10%SDS-PAGE電泳，濕轉PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h后，與兔抗人CD44單克隆抗體(1:5000)37℃孵育 2h；1×TBS-T(1×TBS，0.05 Tween 20)充分洗滌，然后用辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(1:3000)37℃孵育2h；洗膜后用加入ECL發光液浸泡2min，暗室顯影、定影。

2 結果

2.1 CD44基因檢測 除K562細胞組擴增結果為陰性外，9例臨床標本和HL-60細胞的PCR產物電泳均獲得特異性電泳條帶(結果未展示)。PCR結果測序后經DNAman軟件比對分析，發現HL-60 CD44與9例臨床標本序列差異較大，其與參考序列比對發現其匹配度為 83.83%(見圖1)；再以BLASTX程序比對nr蛋白庫，發現HL-60細胞與CD44isoform4型一致性最高，但第21位出現4個氨基酸HPHQ(H:組氨酸,P:脯氨酸,Q:谷氨酰胺)，160~213氨基酸出現較高頻率的點突變；其余標本為CD44isoform4型(NP_001001391.1)。比對結果見圖2。

圖1 HL-60細胞CD44測序部分結果

圖2 HL-60細胞CD44測序結果的BLASTX比對分析

2.2 pET32-CD44鑒定結果 PCR鑒定pET32-CD44轉化子，1%瓊脂糖凝膠電泳見DNA條帶位置與預計的產物804bp一致 (圖3)；測序結果與Genbank序列比對完全一致，部分峰型圖結果見圖4。

圖3 pET32-CD44質粒鑒定圖

圖4 pET32-CD44質粒部分測序結果

2.3 CD44胞外區誘導表達條件的優化 pET32-CD44轉化BL21(DE3)后，經IPTG誘導表達。CD44的優化表達結果，各溫度、各時間點表達產物進行10%SDS-PAGE電泳(圖5)。與不含質粒BL21(DE3)相比在53KD處出現一條蛋白表達條帶，片段大小與預期值相符。用BandScan5.0軟件分析發現，IPTG濃度對目的蛋白表達量影響不大 (圖5A)，1 mM IPTG，37℃誘導2h的表達量最大，占總蛋白的48.6%。

2.4 CD44的表達形式分析 誘導表達產物的10%SDS-PAGE結果見圖6。BandScan5.0分析hCD44om在2h細菌裂解液的沉淀中占總蛋白的37.3%，在上清中占總蛋白的14.2%；在3h細菌裂解液的沉淀中占總蛋白的23.8%，在上清中占總蛋白的21.8%，表明該蛋白在菌體中同時有包涵體和可溶表達兩種形式，隨著誘導時間不同，蛋白存在形式發生改變。

圖5 蛋白表達產物10%SDS-PAGE結果

圖6 SDS-PAGE分析蛋白表達形式

2.5 Western blot鑒定 1mM IPTG 37℃誘導2h細菌裂解沉淀經SDS-PAGE電泳后轉膜后以兔抗人CD44單克隆抗體(1:5000)為一抗，進行ECL顯影(圖7)，結果發現在53KD處出現特異性條帶，且顯色條帶隨蛋白加入量增加而增強。

圖7 Western blot分析人CD44蛋白特異性

3 討論

近年來在研究CD44基因及蛋白結構和生物學功能的基礎上，對其在腫瘤發生、發展、轉移中的機制進行了大量探索[17]，對腫瘤干細胞的表型研究亦發現CD44為多種腫瘤干細胞的細胞表面標記物，因此針對CD44的靶向治療可能揭示分子靶點治療的新前景。

CD44基因含20個外顯子(exon)，其中exon1~5，exon16~20為組成型表達，中間的exon6~15則為可變表達，因此命名為v1~v10[18]。CD44v轉錄方式十分復雜，其中，CD44v6亞型高表達與實體腫瘤轉移、侵襲密切相關；而CD44v在血液腫瘤中的研究尚不夠清楚。

本實驗基于CD44基因剪切模式研究進展，設計上游引物位于exon1上，下游引物跨exon16、exon17a，因此，理論上可以檢測到不同的CD44v亞型。測序結果顯示AML、CML臨床標本均為CD44isoform4 型 (圖 1)，HL-60 為 CD44isoform4 變異性，且有多個氨基酸發生突變。估計與細胞株基因組不穩定有關。此外，未能在K562細胞株中檢出CD44(重復3次)，與文獻報道不一致，原因不明[14,19,20]。

在蛋白表達方面，試驗發現pET32a/BL21(DE3)原核表達系統不能夠表達CD44全長蛋白(其編碼區CDS插入到pET32a(+)的EcoR I和HindⅢ酶切位點之間，數據未顯示)，而重新設計引物克隆無信號肽的CD44胞外區則可以被IPTG高效誘導表達。在課題組前期進行的CD96蛋白的表達中也觀察到類似的情況[21]，估計這與CD44信號肽和跨膜區氨基酸極性有關。本文對蛋白原核表達所用IPTG濃度、溫度和誘導時間進行優化，發現IPTG濃度對CD44表達量影響不大，37℃結果略高于30℃，2~3h時達到較高的表達水平，這與CD96蛋白誘導條件不同[21]。

試驗發現CD44在細菌裂解液沉淀和上清中含量在不斷變化，表明該蛋白以包涵體和可溶性形式表達，同時隨著誘導時間延長，蛋白存在的形式也發生改變。此外，Western blot分析發現：CD44單克隆抗體在53KD處有條帶，在53KD條帶下還有小的拖尾帶，可能是目的蛋白降解所致。

綜上所述，本實驗發現AML和CML患者外周血細胞表達CD44isoform4型分子，HL-60細胞為CD44isoform4變異性，K562細胞中不表達CD44，為后續研究CD44在髓系白血病中的作用奠定基礎；同時，實驗獲得CD44isoform4胞外區片段，為進一步研究單克隆抗體制備提供了基礎。

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