FLAER檢測及其在陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥診斷中的意義

劉淑媛，萬臘根，聞芳，李欣，張長林

(南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006)

陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一種或幾種造血干細胞發生PIG-A基因突變，導致糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol,GPI)錨蛋白合成障礙，引發細胞膜錨連蛋白缺失，補體活化異常所致的溶血性疾病[1]。目前通過流式細胞儀檢測細胞膜表面CD55、CD59的缺失已成為診斷PNH的首選實驗方法；但CD55、CD59等補體調節蛋白的表達還會受到其它因素的影響，如骨髓增生異常綜合征(MDS)、細胞發育不全等均有可能導致膜蛋白的缺失[2]，因此仍有一定的局限性。隨后，Brodsky等[3]發現PNH細胞對氣單胞菌溶素抵抗，利用這一特性可區分GPI+和GPI-細胞。經過改進，目前已經可以用熒光標記嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體(fluorescent aerolysin,FLAER)，使之成為診斷PNH更特異的方法。我們利用流式細胞儀對臨床患者的血標本進行FLAER及CD55、CD59檢測，對其結果進行比較，以探討FLAER檢測在PNH診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 所有患者均為南昌大學第一附屬醫院2013年至2014年的門診或住院患者。其中PNH患者10例，經補體相關溶血試驗及流式細胞術檢測確診；非PNH貧血患者37例，均為缺鐵性貧血、巨幼細胞性貧血等營養不良性貧血患者。

1.2 儀器與試劑 美國Beckman-Coulter公司FC500 型流式細胞儀 (FCM)，CD14-ECD、CD24-PC5、CD55-PE和CD59-FITC熒光標記單克隆抗體、FLAER試劑及紅細胞裂解液均購自美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3 .1 外周血紅細胞CD55、CD59檢測 EDTA抗凝外周血標本以生理鹽水稀釋，調整紅細胞數為109/L；取30μl紅細胞懸液于流式專用試管中，分別加入3μlFITC標記的鼠抗人CD59和3μlPE標記的鼠抗人CD55抗體，混勻后室溫避光標記15min；生理鹽水洗去游離抗體，加入600μl生理鹽水懸浮細胞，用流式細胞儀測定細胞表面抗體標記率。

1.3 .2外周血粒細胞、單核細胞FLAER檢測 取30μl全血分別加入 2μlFLAER 試劑、3μlECD 標記的鼠抗人CD14和3μlPC5標記的鼠抗人CD24抗體，混勻后室溫避光標記15min；加入200μl紅細胞裂解液，室溫孵育10min，生理鹽水洗滌2次，加入600μl生理鹽水懸浮細胞，用流式細胞儀測定細胞表面抗體標記率。

1.3 .3統計學分析 用SPSS17.0軟件進行數據分析，數據用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PNH患者外周血紅細胞CD55、CD59抗原缺失表達 經流式細胞儀檢測，非PNH貧血患者的外周血紅細胞表面抗原CD55、CD59均未見明顯表達缺陷，結果顯示CD55、CD59僅存在單一表達峰 (見圖 1A、1B)；CD55－占 (3.31±4.26)%，CD59－占(0.78±1.39)%。 PNH 組中 2 例 CD55－、CD59－＜5%，8例患者外周血中同時存在正常及CD55、CD59缺陷的2群紅細胞，部分患者在弱陽性區可見一群細胞，為CD55/CD59部分缺陷的紅細胞(見圖1E)；紅細胞膜CD55、CD59抗原表達缺失率分別為(35.54±21.91)%和(32.32±22.04)%，與非 PNH 貧血組比較明顯升高(P＜0.05)，見表 1。

圖1 PNH患者和非PNH貧血患者外周血紅細胞CD55、CD59檢測

表1 PNH組和非PNH貧血組外周血細胞抗原缺失率(x±s，%)

2.2 PNH患者外周血FLAER檢測分析 通過多參數流式細胞術檢測，分別采用CD14、CD24對外周血單核細胞、粒細胞進行靶向標記，結果顯示，PNH患者外周血粒細胞FLAER陰性率達 (82.52±25.24)%，單核細胞FLAER陰性率達 (79.84±19.86)%；與CD55、CD59的陰性率相比，有顯著升高 (P＜0.05)。其中6例PNH患者同時伴有CD24、CD14抗原的缺失(見圖2A、2B)。對于PNH患者，FLAER分析檢出率達100%；而CD55、CD59抗原缺失檢測存在2例陰性結果(如圖3所示)。非PNH貧血患者外周血粒細胞和單核細胞均為FLAER陽性(見圖2C、2D)。由此可見，外周血FLAER檢測的敏感性和特異性均比CD55、CD59檢測更好。同時，與傳統的CD55、CD59相比，FLAER分析法區分的GPI+和GPI－2群細胞也更直觀，易于分辨(圖2 所示)。

3 討論

陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性紅細胞膜缺陷性疾病，臨床表現主要為清晨醬油色尿，慢性血管內溶血，可伴有全血細胞減少和反復血栓形成[4]。傳統診斷PNH常用的方法有Ham試驗、蔗糖溶血試驗、尿Rous試驗等；但這些方法敏感性、特異性差，容易受到其它因素的影響，如PNH發作時呈典型的血管內溶血，Ham試驗陽性具有診斷價值[5]，而對于緩解期臨床癥狀好轉的病人，Ham試驗等溶血性貧血相關試驗常呈陰性，易造成漏診。

圖2 PNH患者和非PNH貧血患者外周血粒細胞、單核細胞的FLAER分析

圖3 對1例PNH患者外周血細胞FLAER與CD55、CD59檢測比較

20世紀80年代以來，對PNH的研究逐步深入，該病的發生機制被證實是由于造血干細胞發生PIG-A基因突變，導致糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨蛋白合成障礙，造成血細胞表面錨連蛋白的缺失，紅細胞因表面缺乏補體調節蛋白如CD55、CD59而對補體敏感[1]。而PNH患者的多數臨床表現均可歸因為受累細胞表面此類蛋白的缺乏。因此通過流式細胞術檢測細胞表面補體調節蛋白CD55、CD59逐漸成為診斷PNH的金標準，并可以對PNH血細胞進行定量分析[6]。隨著研究的不斷深入，學者發現很多干細胞疾病(如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等)和免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡等)患者中均可檢出 CD55－/CD59－細胞[7-9]，CD55、CD59檢測對于PNH的診斷仍有一定的局限性。在這種情況下人們找到了FLAER分析法彌補其不足。1999年，Brodsky等[3]發現PNH細胞對氣單胞菌溶素抵抗，利用這一特性可區分GPI+和GPI-細胞。經過改進，用熒光標記嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體 (fluorescent aerolysin,FLAER)，使之特異性地與細胞膜上的GPI錨連蛋白結合而直接反映錨連蛋白的缺失情況。因此FLAER診斷的特異性與其它靶向標記抗原相比較而言有所提高。

本研究中，我們采用流式細胞術對10例PNH患者和37例非PNH貧血患者進行檢測，結果表明FLAER對區分正常和異常的細胞群更加明顯，并且非PNH患者FLAER呈100%陽性，而CD55－占(3.31±4.26)%，CD59－占 (0.78±1.39)%。 由此說明FLAER分析法較CD55、CD59檢測假陰性率低，特異性好。通過對FLAER和CD55、CD59檢測結果進行比較，對于PNH患者，FLAER分析檢出率達100%；而CD55、CD59抗原缺失檢測存在2例陰性結果 (如圖3所示)。這2例患者外周血紅細胞CD55－、CD59－＜5%， 而 FLAER 檢測粒細胞陰性率分別為67.3%、17.4%，單核細胞陰性率分別為54.3%、52.5%，明顯存在GPI錨連蛋白的缺失。造成這一結果的原因一方面可能是PNH患者處于發作期，呈典型的血管內溶血的臨床表現，紅細胞溶解而影響紅細胞表面抗原檢測結果；另一方面可能是貧血患者采用輸血作為治療手段，導致CD55、CD59缺陷紅細胞稀釋而影響檢測結果。同時，由于紅細胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好地與錨連蛋白結合，因此我們首先利用CD24和CD14對粒細胞和單核細胞進行靶向標記，再進行FLAER分析。這樣提高了FLAER檢測的敏感度，避免輸血或溶血導致的PNH克隆的減少，對于PNH的診斷更有意義。此外，我們發現PNH患者外周血中粒細胞FLAER陰性率達(82.52±25.24)%，單核細胞 FLAER陰性率達(79.84±19.86)%，PNH 克隆數明顯大于 CD55、CD59抗原檢測。進一步說明與CD55、CD59檢測相比，FLAER技術對PNH診斷具有更大的優勢。

目前已證實PNH的發生是由于造血干細胞PIG-A基因突變所致，PNH克隆可累及幾乎所有血細胞；本研究結果顯示在10例PNH患者外周血中，紅系PNH克隆數均明顯低于粒系和單核系，說明紅系的PNH克隆檢測并不能完全反映患者的真實情況，這可能與紅細胞壽命較短有關。因此，FLAER對白細胞的分析能夠更可靠地反映PNH克隆情況，這對PNH微小克隆的檢測、PNH血栓形成的風險評估及其治療具有重要意義。

綜上所述，FLAER技術對PNH的診斷比CD55、CD59檢測更加特異、敏感、直觀；FLAER分析更能反映PNH克隆的變化情況，對PNH微小克隆的檢測及治療具有重要價值。

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