植物細胞程序性死亡中的半胱氨酸蛋白酶研究進展＊

王東方，曹 慧

（山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室 濰坊學院，山東 濰坊 261061）

程序性死亡或細胞凋亡（programed cell death，PCD）是多細胞生物體中一些細胞所采取的一種由自身基因調控的主動死亡方式［1］。近年來隨著動物和醫學中細胞凋亡的深入研究，植物的PCD 研究也成為植物學研究的熱點領域。許多研究表明，在眾多的環境脅迫例如干旱、高低溫和鹽堿脅迫下半胱氨酸蛋白酶mRNA 會積累［2-3］，在植物發生PCD 的某些發育階段過程中半胱氨酸蛋白酶mRNA 也會增加，這說明半胱氨酸蛋白酶（Caspase）與植物發生PCD 有關［4］。

1 Caspase的基本結構和分類

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase），是一組與細胞因子成熟和細胞凋亡有關的蛋白，是富含半胱氨酸的一類蛋白酶家族，它們的活性位點均包含半胱氨酸殘基，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進行切割，從而造成細胞凋亡。Caspase蛋白家族是細胞自殺機制的主要“執行者”，Caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的啟動細胞死亡程序的執行階段［5］。Caspase以前體形式合成，Caspase前體是由兩個亞單位組成的異二聚體，每個有活性的Caspase均來自于兩個前體的加工與結合，其后再形成異四聚體。Caspase活化經兩次裂解，裂解位點均在天冬氨酸羥基端肽鍵，蛋白酶前體被切斷成三部份，H2N-端是抑制區域被移去，另一端COOH-端斷裂成一大一小亞單位稱為死亡區域，在每個二聚體內大小亞單位相嵌形成一個以p片層組成的核心，兩側有α螺旋，兩大兩小亞單位再結合成活化酶，該四聚體在分子對應的兩端有兩個活性位點，可作用于其自身和其他Caspase酶原，按順序依次激活Caspase，形成信號傳導機制的酶級聯反應［6-7］。這種連鎖反應的進行有賴于Caspase的調節蛋白、輔助因子、反饋關系和閾限等控制。

Caspase有多種，多數和凋亡有關，少數和炎癥有關［8］。根據Caspase在級聯反應上下游的位置及功能的不同可將Caspase家族大致分為兩種類型：I型Caspase，又稱為啟動型Caspase（Initiator Caspase），包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等，位于Caspase級聯反應的最上游，能在其他蛋白輔助因子的參與下發生自我活化并激活下游的Caspase；Ⅱ型Caspase，又稱為執行型Caspase（Executioner Caspase），包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，其作用在于特異性地裂解底物使細胞發生生化及形態學改變，最終導致細胞凋亡。除此之外，還有一類Caspase包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-13、Caspase-14等，主要參與細胞因子介導的炎癥反應并在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中起輔助作用［9］。

2 Caspase參與了植物PCD 的過程

Caspase的研究源于線蟲（C.elegans）細胞程序化死亡的研究，是哺乳動物PCD 啟動和執行階段的關鍵調節因子，植物中雖然沒有分離出caspase基因，但是在植物細胞死亡過程中檢測到caspase活性的提高，已有證據表明植物細胞凋亡過程中發生半胱氨酸蛋白酶的活化，推測其分子結構與動物不同，在PCD中執行的功能也可能不同［10］。用動物Caspase活性分析試劑盒檢測到湖北海棠根系存在Caspase-3或Caspase-7活性［11］；研究蘋果砧木新疆野蘋果和平邑甜茶細胞程序性死亡時，通過蛋白免疫印跡實驗發現干旱脅迫條件下兩種蘋果葉片都有類Caspase-3蛋白酶的發生，而根中沒有，通過Western bolt檢測出類Caspase-3的分子量大約是40KD，比動物的類Caspase-3的分子量（32KD）大8KD 左右［12］。

2.1 植物Caspase的種類

序列分析表明，在擬南芥基因組中，沒有編碼Caspase酶類的基因，但是在正在死亡的植物細胞中可以檢測到Caspase活性的升高，說明植物細胞程序性死亡過程依靠的是具有Caspase酶活性的其它種類的蛋白酶?；蚪M序列比對表明，植物中的某些序列編碼的蛋白酶與Caspase在空間結構上具有一定的相似性，而且常用的Caspase酶類抑制劑可抑制其活性。在用menadione誘導煙草原生質體細胞程序性死亡的研究中發現，Caspase的抑制劑Ac-DEVD-CHO 和Ac-YVAD-CHO 可以阻止DNA 的斷裂和PARP（poly-（ADP-ribose）polymerase）的降解［13］。目前，植物中已鑒定出來的半胱氨酸蛋白酶可以分為三類，其中豆類天冬氨酸蛋白內切酶（1egumain）家族的液泡加工酶（vacuolar processing enzymes，VPEs）和metacaspase屬于半胱氨酸內肽酶，它們在氨基酸序列及空間結構上與Caspase具有相似性，是Caspase的同系物；絲氨酸內肽酶（saspases）屬于枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，可以裂解人工合成的Caspase底物。最近的研究表明，VPEs、metacaspase和saspases在植物細胞程序性死亡過程中均起到類似Caspase酶類的關鍵性調控作用，參與調控植物PCD。

2.2 動植物Caspase的異同

與動物細胞凋亡重要組分Caspase相似，植物半胱氨酸蛋白酶也參與植物細胞死亡的調控。Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）參與H2O2誘導的植物PCD，而植物PARP的降解依賴于細胞色素C釋放到胞質中，可被特異的Caspase-3抑制劑所抑制［14］。

動植物中的半胱氨酸蛋白酶的區別主要有以下兩點：（1）亞細胞結構中的定位不同，植物半胱氨酸蛋白酶定位于液泡和細胞壁，葉綠體中的半胱氨酸蛋白酶可以降解Rubisco，而動物Caspase蛋白酶活性僅存在于細胞質中，而不存在于液泡中；（2）同源性較低，研究表明，植物中的半胱氨酸蛋白酶從基因編碼到蛋白質結構和功能與動物Caspase蛋白家族相比均呈現出較低的同源性，所以對植物中是否真正存在與動物相似的由半胱氨酸蛋白家族介導的PCD 調控與執行機制還存在爭議。

2.3 植物Caspase及其編碼基因

盡管對于半胱氨酸蛋白酶如何被生長發育或外部刺激信號激活，以及其如何參與調控細胞死亡的具體過程還不清楚，但關于半胱氨酸蛋白酶，已經從許多植物中成功的分離出其編碼基因，根據植物半胱氨酸蛋白酶的基因表達特點可將其分為三類。

2.3.1 存在于植物正常發育過程中或在植物某些特殊時期表達的半胱氨酸蛋白酶

Carne和Moore從中華獼猴桃（Actinidia chinensis）果實中分離到了一種半胱氨酸蛋白酶，并得到了其氨基酸序列，即actinidain［15］。Mbeguie等在研究杏樹果實成熟時發現一個編碼半胱氨酸蛋白酶基因高度表達，并成功提取其mRNA，為今后的研究提供了基礎［16］。Lee等分離到水稻半胱氨酸蛋白酶基因OsCP1，通過表達模式分析發現OsCP1基因在水稻花藥絨氈層及未成熟的花藥中表達，T-DNA 插入突變體分析發現其主要參與水稻花粉發育過程［17］。嚴秀蕊等在水稻發育過程中發現半胱氨酸蛋白酶相關基因OsCP2，其也在水稻花藥絨氈層及未成熟的花藥中表達，且只在花粉發育的空泡花粉時期到成熟時期進行表達［18］。張紅巖等采用SSH（Suppression subtractive hybridization）和Race-PCR（Rapid-amplification of cDNA ends）技術克隆得到來自甘藍型油菜（Brassica napus L.）矮化突變體‘NDF-1’的一個半胱氨酸蛋白酶相關基因Bncp5，相對定量RT-PCR 檢測表明此基因具有組織表達特異性［19］。Tripathi在玫瑰花瓣脫落過程中發現轉錄激活一個37KD 的伴隨乙烯反應的半胱氨酸蛋白酶基因RbCP1，該基因與蛋白質的降解過程聯系密切［20］。張國林等在花生果種皮中發現一個半胱氨酸蛋白酶基因AhPSG13，RT-PCR 檢測表明該基因在果種皮中特異表達［21］。

2.3.2 在生物脅迫和非生物脅迫條件下誘導表達的半胱氨酸蛋白酶

在對擬南芥的逆境研究中發現了RD（responsive to dehydration）系列基因，包括rd19A 和rd21A 以及rd29A／cor78／lit78［22］。RD 系列基因已經成為逆境研究中的重點，對于逆境信號轉導路徑的交叉研究具有重要意義。臧慶偉以水分脅迫24h的cDNA 文庫中WSI-V-F10克隆的EST 為基礎，通過RACE方法獲得了小麥半胱氨酸蛋白酶基因TaCP（AY841792）［23］。朱家紅從橡膠樹膠乳中克隆了一個半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1（DQ642886），半定量RT-PCR 結果顯示，乙烯和傷害誘導膠乳HbCP1基因的表達，推測膠乳中的HbCP1 蛋白可能具有防御功能［24］。曹慧等在蘋果屬植物八棱海棠中也克隆到了Caspase基因［25］。

2.3.3 在衰老的植物器官表達量增加或在衰老時期特異表達的半胱氨酸蛋白酶

由于衰老也是一種主動的、內在因子調控的有序過程，并且與細胞死亡相關，有時將衰老視為程序化死亡過程［26］。在各種衰老的植物器官中分離到了許多編碼半胱氨酸蛋白酶的基因，它們被稱作衰老相關基因SAG（senescence associated genes），如擬南芥的SAG2和SAG12，玉米的See1和See2，油菜的LSC7和LSC790［27］，番茄的Cyp23［28］和煙草的NTCP223［29］，這些基因在衰老的葉片中均被上調。王勇等在研究大豆葉片衰老過程中發現了一個半胱氨酸蛋白酶相關基因，其在衰老的葉片中特異性表達［30］。沈法富等從遼棉9號衰老葉片中克隆了編碼半胱氨酸蛋白酶的cDNA，命名為Ghcysp（AY604196），基因表達分析表明，該基因在棉花的根、下胚軸、花、胚珠和幼葉中不表達，而在棉花的衰老葉片中特異性表達［31］。朱海生等在草莓中克隆島半胱氨酸蛋白酶基因FaCP，并發現隨著衰老程度的增加，FaCP 基因表達量逐漸增加，特別在衰老后期，顯著上升［32］?；ㄒ嘶ò晁ダ线^程中半胱氨酸蛋白酶比對照也有顯著表達［33］。

3 結束語

半胱氨酸蛋白酶作為一類重要的蛋白酶家族，廣泛參與植物的各種生理過程。半胱氨酸蛋白酶參與貯藏蛋白的降解，在響應逆境脅迫時負責蛋白的周轉；參與響應病菌侵襲時的超敏反應；參與木質部分化和器官衰老引發的PCD。半胱氨酸蛋白酶基因不僅與植物的衰老相關，同時也參與信號傳導響應外界環境中的生物和非生物脅迫［14，34］但在植物響應非生物脅迫和生物脅迫以及器官分化和衰老的過程中，半胱氨酸蛋白酶的功能仍不夠明確，caspase酶類在植物中的真正功能還不清楚，有關植物細胞程序性死亡蛋白酶的研究尚處于起始階段，但隨著動物細胞凋亡研究的深入，將會進一步揭示植物細胞程序性死亡中caspase酶類作用機理和機制。

［1］Keer J F，Wyllie A H，Carrie A R.Apoptosis：A basic biolclgical phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26（4）：239-245.

［2］Jennifer T J，John E M.A Salt-and dehydration-inducible pea gene，Cyp15a，encodes a cell-wall protein with sequence similarity to cysteine protease［J］.Plant Molecular Biology，1995，28（6）：1055-1065.

［3］Masahiro K，Kazuko Y，Hideo T，et al.Structure and expression of two genes that encode distinct drought-inducible cysteineproteinases in Arabidopsis thaliana［J］.Gene，1993，129（2）：175-182.

［4］Tadamasa U，Shigemi S，Yuko O，et al.Circadian and senescence-enhanced expression of a tobacco cysteineprotease gene［J］.Plant Molecular Biology，2000，44（5）：649-657.

［5］Shi Y.Mechanism of caspase activation and inhibition during apoptosis［J］.Mol Cell，2002，9（3）：459-470.

［6］Howard Y，Chang H Y，Yang X.Proteases for cell suicide：functions and regulation of Caspases［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2000，64（4）：821-846.

［7］Nicholson D W.Caspase structure，proteolytic substrates，and function during apoptotic cell death［J］.Cell Death Differ，1999，6（11）：1028-1042.

［8］Thornberry N A，Lazebnik Y.Caspases：enemies within［J］.Science，1998，281（5381）：1312-1316.

［9］Tschopp J，Martinon F，Burns K.NALPs：a novel protein family involved in inflmmation［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（2）：95-104.

［10］馬懷宇，肖靜，楊洪強.水分脅迫下湖北海棠根系線粒體及細胞死亡特性研究［J］.園藝學報，2007，34（3）：549-554.

［11］譚冬梅.干旱脅迫誘導新疆野蘋果和平邑甜茶細胞程序性死亡的研究［D］.中國農業大學，2005：28-32.

［12］李嘉琦，吳娟.Caspases與細胞凋亡［J］.動物醫學進展，2003，24（1）：53-55.

［13］Sun Y L，Zhao Y，Hong X，et al.Cytochrome c release and caspase activation during menadione-induced apoptosis in plants［J］.FEBS Lett，1999，462（3）：317-321.

［14］Grudkowska M，Zagdanska B.Multifunctional role of plant cysteine proteinases［J］.Acta Biochemical Polonica，2004，51（3）：609-624.

［15］Carne A，Moore C H.The amino acid sequence of the tryptic peptide from actinidin，aproteolytic enzyme from the fruit of Actinidia chinesis［J］.Biochemical Journal，1978，173（1）：73-83.

［16］Ryan S N，Laing W A，McManus M T.A cysteine proteinase inhibitor purified from apple fruit［J］.Phytochemistry，1998，49（4）：957-963

［17］Lee S，Jung K H，An G，et al.Isolation and characterization of a rice cysteine protease gene，OsCP1，using T-DNA gene-trap system［J］.Plant Mol Biol，2004，54（5）：755-765.

［18］嚴秀蕊，張大生，梁婉琪，等.水稻半胱氨酸蛋白酶OsCP2的特征分析及其原核表達與純化［J］.上海交通大學學報：農業科學版，2010，28（2）：140-146.

［19］張紅巖，薛華，馬欣榮，等.甘藍型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA 的克隆及組織特異性表達分析［J］.應用與環境生物學報，2008，14（2）：172-176.

［20］Tripathi S K，Singh A P，Sane A P，et al.Transcriptional activation of a 37kDa ethylene responsive cysteine protease gene，RbCP1，is associated with protein degradation during petal abscission in rose［J］.J Exp Bot，2009，60（7）：2035-2044.

［21］張國林，石新國，蔡寧波，等.花生果種皮特異表達基因AhPSG13的克隆和表達研究［J］.中國油料作物學報，2010，32（1）：35-40.

［22］朱海生，陳敏氡，溫慶放，林琿.草莓半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及表達分析［J］.農業生物技術學報，2013，21（2）：158-164.

［23］Rossano R，Larocca M，Riccio P.2-D zymographic analysis of Broccoli（Brassica oleracea L.var.Italica）florets proteases：follow up of cysteine protease isotypes in the course of post-harvest senescence［J］.Jourmal of Plant Physiology.2011，168（13）：1517-1523.

［24］朱家紅.巴西橡膠樹半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1的克隆與表達分析［D］.華南熱帶農業大學，2007：66.

［25］曹慧，程姣姣，劉春香，等.干旱脅迫下八棱海棠PCD 特征檢測及類Caspase基因片段的克隆與分析［J］.果樹學報，2012，29（4）：525-529.

［26］Nooden L D，Guiamet J J.Genetic control of senescence and aging in plants［M］.In：Handbook of the Biology of Aging，edn 4.Edited by Schneider EL，Rowe JW Orland.Academic Press，1996，28：94-118.

［27］沈成國，關軍鋒，王曉云，等.植物衰老生理與分子生物學［M］.北京：中國農業出版社，2001：355-359.

［28］Adams J M，Corry S.The Bcl-2protein family：arbiters of cell survival［J］.Science，1998，9（2）：1322-1326.

［29］王勇，夏建潤，王寧寧，等.與大豆葉片衰老相關的cDNA 的克隆［J］.南開大學學報：自然科學版，1999，32（3）：182-188.

［30］沈法富，喻樹迅，韓秀蘭，等.棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和表達特性分析［J］.科學通報，2004，49（22）：2318-2323.

［31］Chichkova N V，Kim S H，Titova E S，et al.A plant Caspase-like protease activated during the hypersensitive response［J］.Plant Cell，2004，16（1）：157-171.

［32］King K L，Gidlowski J A.Cell cycle regulation and apoptosis［J］.Annu Rev Physiol，1998，60（9）：601-617.

［33］臧慶偉.小麥抗旱相關基因TaCP和TaLTPl的克?。跠］.中國農業科學院，2005：27-32.

［34］Chen H J，Su C T，Lin C H，et al.Expression of sweet potato cysteine protease SPCP2altered developmental characteristics and stress responses in transgenic Arabidopsis plants［J］.Journal of Plant Physiology，2010，167（10）：838-847.