實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)C57BL/6J小鼠模型構建

黃夏冰 康巧珍 王曉東 丁聰 江慧 劉詩夢 劉鑫

(鄭州大學生命科學學院 河南鄭州 450001)

多發性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是一種慢性中樞神經系統(central nervous system，CNS)損傷的自身免疫疾病，成年人中最為常見，平均發病年齡為20～40歲［1－2］。MS的發病原因至今還不清楚，有研究表明，可能是多種基因與環境的相互作用導致疾病的發生［3］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠是研究 MS的經典動物模型，由自身抗原特異性T細胞介導自身免疫疾病，在臨床表征和病理特征上與MS極為相似。目前EAE的誘導方法可分為主動誘導法和被動誘導法。主動誘導法主要是通過皮下注射特定的髓鞘蛋白或其特定肽段加完全弗氏佐劑免疫小鼠;被動誘導法是通過轉移已致敏的CD4+T細胞進行過繼免疫誘導。通過選擇動物品種和品系及不同的抗原和免疫方法，可誘導出慢性不復發、復發－緩解型和繼發進展型EAE模型，用于模擬不同的MS疾病類型。例如，用髓鞘堿性蛋白MBP89－101免疫SJL/J小鼠構建急性非復發型EAE模型，用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白MOG35－55免疫C57BL/6J構建慢性非緩解型EAE模型，用髓鞘脂蛋白PLP139－151免疫SJL/J小鼠構建復發 －緩解型EAE模型［4－6］。

MOG35－55免疫C57BL/6J小鼠構建的EAE模型在病程上表現為急性發作、不緩解的慢性過程。其發病的過程為:皮下注射的 MOG35－55刺激系統性免疫應答，自身抗原特異性T細胞在外周淋巴器官擴增后遷移到中樞神經系統外圍與髓鞘蛋白再次相遇，形成大量的抗原特異性T細胞，穿過血腦屏障，最后進入中樞神經系統，導致脫髓鞘損傷［7］。本實驗通過MOG35－55免疫 C57BL/6J小鼠建立主動免疫性的慢性－非緩解的EAE模型，旨在為以后研究MS的發病機制和治療方法奠定基礎。

1 材料方法

1．1 材料與試劑 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白MOG35－55多肽(上海科肽生物技術有限公司合成，純度＞95%)，百日咳毒素購自于美國Sigma公司，含有10 mg/ml結核分枝桿菌的完全弗氏完全佐劑購自美國Chondrex公司。

1．2 實驗動物 SPF級雌性8～10周C57BL/6J小鼠(16～20 g)，購自北京維通利華公司，所有小鼠在相同環境下喂養，飼養環境溫度20～25℃。飼養以及實驗過程符合《實驗室動物飼養和使用條例》。

1．3 EAE模型的建立 C57BL/6J小鼠隨機分為EAE組和對照組，各5只。MOG35－55多肽用PBS稀釋后與完全弗氏佐劑等體積混合，用一次性三通管連接固定玻璃注射器在冰上反復吹打30 min以上，最終制成油包水的乳化劑。EAE組每只小鼠注射含有MOG35－55多肽300 μg 的0．2 ml乳化劑(結核分枝桿菌的終濃度為4 mg/ml)。在免疫后0 h和48 h腹腔注射百日咳稀釋液(0．1 ml，200 ng/只)。對照組注射等量生理鹽水。

1．4 EAE小鼠體質量監測及神經功能評分 自免疫當天開始，每天觀察小鼠的攝食情況、小鼠體質量變化。從初次免疫至第32天實驗終止前，采用雙盲法，每天2人至少1次在同一時間按Benson評分標準對EAE的嚴重性進行臨床評估。評分標準如下:0分，正常;1分，尾部無力或蹣跚步態伴尾巴有力;2分，蹣跚步態伴尾巴無力(共濟失調);2．5分，共濟失調伴部分單肢麻痹;3分，單肢完全麻痹;3．5分，單肢完全麻痹并伴隨另一肢體部分麻痹;4分，雙肢完全麻痹;4．5分，四肢麻痹;5分，死亡。

1．5 病理組織學檢測 在EAE小鼠發病的高峰期進行取樣:將小鼠注射戊巴比妥鈉鹽麻醉后，用4%的多聚甲醛進行心臟灌流。取出小鼠的大腦和脊髓置于4%多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋后制成6μm厚切片后進行常規H＆E染色，于倒置顯微鏡下觀察病理學組織形態。

2 結果

2．1 EAE小鼠的行為及神經功能評分 C57BL/6J EAE小鼠發病表現為活動少，進食少，體質量明顯下降。臨床癥狀為尾部松弛無力，步態蹣跚，雙后肢依次呈現麻痹狀態，行動困難，且臨床評分隨著時間延長加重，見圖1。大多發病小鼠癥狀無緩解，但是有小部分小鼠癥狀稍微減輕。EAE組小鼠從免疫后第16天開始陸續發病，至第20天5只小鼠均發病，平均發病時間為(17．6 ±2．19)d，最高評分可達(2．7 ±0．57)分。對照組小鼠未出現神經系統癥狀，食欲無變化，體質量持續增加，Benson評分為0分。

圖1 EAE小鼠臨床行為打分

2．2 EAE小鼠病理組織學檢測 EAE組小鼠腦和脊髓實質中均有大量炎性細胞浸潤，在脊髓腰膨大區更為明顯，表現為大量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，并且腦組織小血管周圍形成血管袖套樣浸潤。對照組小鼠腦和脊髓均未見明顯異常改變。見圖2、3。

圖2 EAE小鼠脊髓病理學切片

圖3 EAE小鼠腦組織病理學切片

3 討論

MS是一種慢性、炎癥性、脫髓鞘的中樞神經系統自身免疫疾病。EAE是一種由致敏性CD4+T細胞誘導產生的，在臨床表征和病理特征上與MS極為相似的自身免疫性疾病模型［8］。動物疾病模型的建立對疾病的發病機制、臨床診斷、治療以及各種靶分子的檢測具有重要意義，制備理想的、成熟的動物模型是研究人類疾病的重要手段和前提。

本研究采用免疫原MOG35－55誘導C57BL/6J小鼠建立EAE模型。將MOG35－55與完全弗氏佐劑混勻，充分乳化有利于延長抗原在體內的殘留時間，為誘發免疫反應提供充分的機會。隨后采用腹腔注射百日咳毒素改善炎性細胞進入中樞神經系統的血腦屏障的阻力，有利于模型的成功構建。采用以上方式免疫C57BL/6J小鼠誘發EAE，具有模型穩定，發病率高的特點。隨后，對EAE小鼠的脊髓、腦組織進行病理學檢測，發現與對照組小鼠相比，EAE小鼠的脊髓、腦組織中有大量的炎性細胞浸潤，在脊髓的腰膨大區更為顯著，并且在小血管周圍有袖套樣淋巴細胞浸潤。

本研究用MOG35－55免疫C57BL/6J，穩定地構建了EAE小鼠模型，為研究MS的發病機制、篩選有效的治療藥物奠定了基礎。

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