胃袖狀切除附加空回腸吻合術對ZDF大鼠GLP-1蛋白表達的影響

周小鋼，王愷京，徐安安，高 瑋，陸佳軍，朱江帆

(同濟大學附屬東方醫院，上海，200120)

近年，減重手術作為治療2 型糖尿病及相關代謝性疾病的重要手段，其作用效果已得到了眾多臨床資料與實驗數據的證實［1-2］。術式主要有胃袖狀切除(sleeve gastrectomy，SG)、胃旁路術及胃袖狀切除附加轉流術等。研究表明，胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide 1，GLP-1)分泌水平變化可能是減重手術治療2 型糖尿病的主要機理［3］。GLP-1 主要是由末端回腸L 細胞分泌，GLP-1 分泌的增強主要由于食物較早地刺激末端回腸L 細胞引起，可有效降低血糖［4-6］。我們之前的研究發現SG 組與胃袖狀切除附加空回腸吻合(sleeve gastrectomy plus side-to-side jejunoileal anastomosis，JI-SG)組術后血清GLP-1 水平明顯升高［7］，然而L 細胞組織學是否發生了改變，對此我們不得而知。基于此，我們在SG 的基礎上附加空回腸吻合術，從而使得食物提早刺激末端回腸，觀察末端回腸黏膜組織L 細胞組織學改變及相應血液激素水平的改變，從而探討GLP-1 分泌水平改變的原因，并進一步檢驗GLP-1 在減重手術中的作用，進而優化減重手術方式。

1 資料與方法

1.1 實驗動物準備與分組 雄性10 周齡糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠30 只(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)，飼養于同濟大學動物實驗中心無特定病原體(specific pathogen free，SPF)環境中，將大鼠按隨機數字表法分為假手術(sham surgery，SS)組、SG 組與JI-SG組。JI-SG 組行胃袖狀切除附加空回腸側側吻合術，SG 組行袖狀胃切除術，SS 組行假手術。

1.2 實驗動物手術干預 SG 組手術方法［8］:沿胃部大彎側縱行切除整個胃底及約3/4 胃體，縫合胃切緣止血后將胃置于原位;JI-SG 組手術方法:上述胃袖狀切除后距Treitz 韌帶及回盲瓣各20 cm 游離出空腸、回腸并行側側吻合術;SS 組手術方法:大鼠開腹后即關閉。各實驗組關腹前均腹腔注射1 ml 慶大霉素，三組實驗時間大致相等，以消除手術應激對結果的影響。

1.3 標本的制備 血清學標本:術前2 d 及術后規律兩周一次取眶靜脈血約0.5 ml，離心后取上清液置于-20 攝氏度冰箱保存;組織學標本:于術后第12 周處死大鼠，并取距回盲瓣5 cm 末端回腸組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，切片機制備石蠟切片。

1.4 檢測項目及方法

1.4.1 血糖 術前2 d 及術后兩周一次眶靜脈采血，使用羅氏血糖儀檢測其血糖水平。

1.4.2 末端回腸黏膜GLP-1 水平測定 采用免疫組化SP法，常規脫蠟水化后抗原修復;放入3%過氧化氫溶液，孵育25 min;滴加Ⅰ抗(購自美國Abcam 公司)，稀釋比例為1∶100;滴加Ⅱ抗，室溫孵育50 min;DAB 顯色，陽性為棕黃色，蘇木素復染，中性樹膠封片。顯微鏡下玻片組織充滿視野拍照，應用Image-Pro Plus 6.0 軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(integral optical density，IOD)，保存圖片中組織的面積(AREA)，IOD/AREA 計算出平均光密度值(Mean Density)。

1.4.3 血清胰島素、GLP-1 水平測定 采用ELISA 法檢測大鼠血清胰島素及GLP-1 水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書(購自美國R＆D 公司)進行。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，量化數據用(均數±標準差)表示，所獲數據呈正態分布，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩顯著性檢測采用LSD-t 檢驗;P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 存活率 SS 組大鼠均存活，存活率100%;SG組大鼠死亡1 只，術后第2 天吻合口漏腹腔感染死亡，存活率為90%;JI-SG 組死亡3 只，其中2 只術后第10 天吻合口粘連狹窄引起梗阻而死亡，另1 只于術后第20 天極度消瘦死亡。3 組總的存活率為86.7%。

2.2 回腸末端黏膜組織學檢測 GLP-1 的產生部位主要位于大鼠回腸末端黏膜組織L 細胞，細胞數量較多，胞質深染。陽性強度分為4 級:染色無色計為0，淡黃色為1，棕黃色2，棕褐色為3。平均光密度值評估GLP-1 在回腸末端黏膜組織表達水平，SS組、SG 組及JI-SG 組分別為:0.008492 ±0.0019246，0.009091 ±0.0021523，0.011408 ±0.0027251。JISG 組平均光密度明顯高于SS 組及SG 組(P ＜0.05)，局部可見L 細胞增生。SG 組平均光密度值高于SS 組。見圖1、圖2、表1。

2.3 血清GLP-1 水平改變 術前各組血清GLP-1水平差異無統計學意義(P ＞0.05)，術后SS 組與術前水平差異無統計學意義(P ＞0.05)。SG 組術后GLP-1 水 平 緩 慢 上 升，至 12 周 達(1. 79 ±0.12)pmol/L，高于SS 組(P ＜0.05)。術后2 周JISG 組由術前(1.69 ±0.1)pmol/L 上升至(1.92 ±0.12)pmol/L，隨后緩慢上升，至12 周達(1.97 ±0.11)pmol/L，術后各時間點與術前相比差異均有統計學意義(P ＜0.05)，術后同時間點與其他兩組的差異也具有統計學意義(P ＜0.05)。見表2。

2.4 血糖水平改變 術前各組血糖水平差異無統計學意義(P ＞0.05)，術后2 周SG 及JI-SG 組血糖即有明顯下降，術后2 周SG 組血糖水平由術前(11.4 ±3.1)mmol/L 降至(6.9 ±1.6)mmol/L，隨后逐漸恢復上升，并超過術前水平，至12 周升至(13.4 ±2.8)mmol/L，但同時間點低于SS 組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。術后2 周JI-SG 組血糖水平由 術前(12. 4 ± 1. 5)mmol/L 降至(6. 3 ±0.7)mmol/L，隨后長時間保持穩定水平，至12 周達到(5.1 ±0.9)mmol/L，同時間點明顯低于SS 組及SG 組(P ＜0.05)。見表3。

2.5 血清胰島素水平的改變 術前各組胰島素水平差異無統計學意義(P ＞0.05)，SS 組胰島素水平呈現緩慢上升，至12 周達(7.51 ±1.6)mU/L。術后2 周，SG 組、JI-SG 組 分 別 由 術 前(5. 13 ±1.2)mU/L、(5. 24 ± 1. 1)mU/L 升 至(6. 53 ±1.4)mU/L、(6.57 ±1.3)mU/L ，呈現與SS 組相同趨勢。隨后緩慢下降，術后12 周SG 組達到(5.21±1.4)mU/L水平，與術前相比差異無統計學意義(P ＞0.05);JI-SG 組達到(4.53 ±1.3)mU/L，明顯低于術前及其他兩組水平(P ＜0.05)。見表4。

圖1 各組末端回腸粘膜組織GLP-1 蛋白表達(1-HE ×200;2-HE ×400)a:SS 組GLP-1 蛋白，胞質淡染;b:SG 組GLP-1 蛋白，胞質染色偏黃色;JI-SG 組GLP-1 蛋白，胞質深染，為棕黃色，細胞數量明顯增加。

圖2 各組GLP-1 在末端回腸黏膜組織表達比較

表1 末端回腸黏膜組織GLP-1 表達光密度值的比較(±s)

表1 末端回腸黏膜組織GLP-1 表達光密度值的比較(±s)

* P ＜0.05 vs.SS 組，ΔP ＜0.05 vs.SG 組

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表2 各組手術前后血清GLP-1 水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

表2 各組手術前后血清GLP-1 水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

* P ＜005 vs.術前;ΔP ＜0.05 vs.SS 組;#P ＜0.05 vs.SG 組

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表3 各組手術前后血糖水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

表3 各組手術前后血糖水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

* P ＜005 vs.術前;ΔP ＜0.05 vs.SS 組;#P ＜0.05 vs.SG 組

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表4 各組手術前后胰島素水平的比較［(±s)，ρ/mU·L-1］

表4 各組手術前后胰島素水平的比較［(±s)，ρ/mU·L-1］

* P ＜005 vs.術前;ΔP ＜0.05 vs.SS 組;#P ＜0.05 vs.SG 組

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3 討 論

SG 是近年備受關注的減重術式之一，具有手術操作簡單、安全、有效、并發癥發生率低等優點［9-12］，然而一些資料也表明了SG 療效不如轉流術、長期療效不明確、術后容易反彈等缺點［13-14］。Melissas等［15］將JI-SG 與單純SG 進行了對比分析，發現JISG 在改善2 型糖尿病方面明顯優于SG;同時也發現JI-SG 術后食物自十二指腸到達盲腸時間為11 min，而SG 術后需要31 min;JI-SG 術后未出現死亡或重大手術并發癥。JI-SG 操作簡單、不改變腸道結構的連續性，因此認為JI-SG 是簡單、安全、有效的減重術式;同時空回腸吻合術可在單純SG 失敗或術后出現反彈的情況下再行實施。本實驗采用ZDF 大鼠制作JI-SG 模型，觀察術后降糖作用及相應激素水平的改變，以探討可能機制。

通過觀察比較我們發現，JI-SG 組GLP-1 水平的血清學檢測水平明顯高于SG 組與SS 組，組織學檢測發現JI-SG 組蛋白表達水平顯著增加，染色為棕黃色，同時伴有L 細胞的增生。在血糖控制、胰島素水平方面，JI-SG 均體現出優勢，JI-SG 術后血糖保持穩定的低水平，而SG 組血糖在術后第二周達到最低值后緩慢回升，表明SG 具有降糖的療效，同時也存在血糖反彈的現象，這與Himpens 等［16］的研究結果一致。然而是什么原因導致了JI-SG 在治療2型糖尿病方面的顯著療效?食物較早刺激末端回腸可顯著增強GLP-1 的分泌，而GLP-1 水平升高是導致血糖下降的關鍵因素。GLP-1 主要由末端回腸L細胞分泌產生，GLP-1 可促進糖原合成、增加胰島素基因表達、胰島素的分泌、抑制胰高血糖素分泌、促進β 細胞增生并抑制其凋亡［17-20］;目前GLP-1 降糖療效已得到證實，相關藥物已應用于臨床［21］。本實驗中血清GLP-1 水平在第2 周即有明顯上升，之后保持穩定水平，第12 周組織學檢測發現L 細胞分泌GLP-1 功能增強同時伴有顯著增生，我們認為L 細胞在發生組織學改變前即有分泌功能增強現象，長期的代償作用導致細胞的增生，這種組織學改變可能是機體長期維持GLP-1 高水平的重要原因。

SG 組大鼠的胃腸道生理結構并未改變，但其組血漿GLP-1 水平及蛋白表達水平均有提高，現有資料表明［22-24］，SG 手術切除胃底、大部分胃體，導致體內Ghrelin 激素水平降低，而Ghrelin 可抑制胰島素的分泌及外周組織利用葡萄糖，同時Ghrelin 可促進胃排空，使得食物較早刺激回腸產生較多GLP-1，因此Ghrelin 激素水平的降低可能是SG 對2 型糖尿病有治療效果的原因之一。朱江帆等［25］則提出“胃中心學說”，認為減重手術關鍵環節在胃大彎，現有主流減重手術均減少了食物對胃的刺激。很有可能導致某種特殊因子分泌減少，從而緩解胰島素抵抗，交感神經張力降低，導致糖尿病、高血壓、多囊卵巢綜合征等代謝性疾病得到緩解，因此更多的胃腸道未知激素尚待研究。

本實驗證實了JI-SG 治療ZDF 大鼠2 型糖尿病的持續有效性，其主要作用機制可能與末端回腸L細胞增生及其分泌GLP-1 增強有關。JI-SG 使部分未消化食糜較早進入末端回腸，起到吸收不良的作用，同時未完全消化食糜較早刺激末端回腸L 細胞，促進其分泌GLP-1 激素。空回腸側側吻合術使包括曠置腸段在內的腸攀均有食物通過，可避免因腸襻曠置導致的菌群改變、膽汁酸代謝改變、曠置腸襻細胞萎縮等問題。“盡量減少胃腸道結構破壞同時獲得最佳減重及改善代謝效果”是減重手術改進的努力方向，此術式為術式改進提供了一個方案，其療效尚待臨床長期的隨訪研究。

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