病毒誘導的基因沉默技術實驗教學設計和實踐

侯巧明, 張 立, 賀新強, 丁 琦

(北京大學 生命科學學院, 生物基礎教學實驗中心, 北京 100871)

病毒誘導的基因沉默技術實驗教學設計和實踐

侯巧明, 張 立, 賀新強, 丁 琦

(北京大學 生命科學學院, 生物基礎教學實驗中心, 北京 100871)

病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術是近年發展起來研究植物基因功能的新方法。利用含有目的基因片段的病毒載體侵染植物,導致植物體內相應的功能基因表達受到抑制成為沉默基因,相應功能缺失,從而推測目的基因的功能。該文克隆了煙草番茄紅素脫氫酶(PDS)基因片段,插入到煙草脆裂病毒載體(TRV)中,構建了pTRV -PDS的 VIGS載體,轉入農桿菌侵染煙草后成功沉默了PDS基因,使煙草葉片出現白化表型,成功建立了煙草VIGS體系。將VIGS這個當前生物學研究熱點引入教學實驗中,改革更新實驗教學內容,有益于學生擴展科研思維。

VIGS； RNAi； 煙草脆裂病毒； 番茄紅素脫氫酶

病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是發現于高等植物的轉錄后基因沉默現象,是宿主抵抗病毒的一種自我保護機制[1]。病毒侵染植物組織后進行復制,合成大量的雙鏈RNA中間體(double stranded RNA,dsRNA),隨之宿主體內具有核酸內切酶活性的Dicer類似物將其切割為小分子干擾RNA (small interfering RNA,siRNA),siRNA與一系列AGO(argonaute)家族蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC),后者特異性識別細胞質中的同源mRNA,并將其切割降解,從而發生基因在轉錄水平的沉默[2-4]。

VIGS的機理初步揭示以后,研究者隨即發展了利用VIGS來研究植物基因功能的技術方法[5]。將植物內源基因片段插入病毒載體,構建重組病毒來侵染植物。由于VIGS的作用導致與插入序列高度同源的內源植物基因mRNA被RNAi系統識別并降解,從而可以得到目的基因表達下調的植株。通過檢測植物表型或生理生化指標上的變化,可以初步推測目的基因的功能。與轉基因、基因敲除等基因功能研究方法相比,VIGS技術具有研究周期短、不需要遺傳轉化、低成本、高通量的優勢,已被廣泛應用于植物生長發育以及代謝調控途徑相關基因的功能鑒定[6-9]。

煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)是目前應用最廣泛的VIGS載體,它便于外源序列的插入和隨后對植物的侵染,具有病毒感染癥狀輕、沉默效率高等優點,在擬南芥、煙草、番茄等多種植物上得到成功應用[6,10]。番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)是類胡蘿卜素合成過程中的關鍵酶,當PDS表達受阻時,植物失去了類胡蘿卜素的光保護作用,從而出現白化現象。PDS基因通常設為VIGS體系評價的參照基因[11-12]。本實驗以本氏煙草PDS基因為研究對象,實驗設計包括煙草RNA提取、反轉錄cDNA、基因克隆、侵染植物基因沉默等內容,表型快速、直觀,非常適合學生理解和掌握VIGS這一新興前沿技術方法。

1 實驗材料和試劑

材料:本氏煙草(nicomiana benthamiana)種植于光照培養室,溫度23～26 ℃,光照16 h/黑暗8 h,萌發3～4周的煙草幼苗適用；大腸桿菌DH5α,土壤農桿菌GV3101；pEASY-T1質粒,pTRV1質粒,pTRV2質粒。

試劑:TR Izol試劑(Invitrogen),反轉錄試劑盒TransScript Ⅱfrist strand cDNA synthesis supermix,質粒提取試劑盒,PCR supermix(全式金公司),內切酶BamH1和Xba1,T4 DNA連接酶,液體LB培養基,農桿菌滲透液(MgCl210 mM,MES 10 mM,乙酰丁香酮150 μM),慶大霉素,卡那霉素。

2 實驗方法

2.1 本氏煙草總RNA提取和反轉錄cDNA

用TR Izol試劑提取煙草的總RNA,反轉錄反應使用北京全式金公司的TransScript Ⅱfrist strand cDNA synthesis supermix,操作按說明書進行。

2.2 VIGS載體的構建

利用NbPDS基因的全長cDNA序列信息設計引物,兩端引入限制性內切酶BamH1和Xba1的酶切位點。通過PCR反應擴增得到NbPDS基因片段。將此片段通過TA克隆的方法連入全式金公司的pEASY-T1載體,通過藍白斑篩選得到陽性克隆后進行測序確認。將含有正確插入片段的pEASY-T1載體用限制性內切酶BamH1和Xba1進行酶切,同時用同樣的限制性內切酶酶切pTRV2空載體。將酶切得到的片段通過T4 DNA連接酶連入酶切消化后的pTRV2載體,經菌落PCR反應和酶切鑒定出陽性克隆,然后提取質粒轉化土壤農桿菌GV3101。最后利用PCR反應鑒定出農桿菌的陽性克隆,保存菌種。

2.3 VIGS實驗

由于煙草脆裂病毒TRV是雙分基因組病毒,而這2部分的基因組在改造后分別克隆在不同的雙元載體中,因此每次沉默實驗都需要同時使用TRV1(包含TRV的RNA1組分)和TRV2(包含TRV的RNA2組分)2種載體。將分別帶有pTRV1載體,空的pTRV2載體和pTRV2-PDS的農桿菌單菌落接種到3 ml LB培養基,28 ℃振蕩培養過夜。5,000 rpm離心10 min收集農桿菌,充分倒盡上清后,用農桿菌滲透液重懸細菌調整農桿菌懸浮液的OD600值為1.0左右,靜置3～5 h后,將等體積的pTRV1農桿菌懸浮液和pTRV2-NbPDS農桿菌懸浮液混合均勻后,開始注射本氏煙草葉片。所注射的本氏煙草為萌發3～4周的幼苗,具有4～6片真葉的茁壯生長的植株,用注射器將混合菌液通過壓迫注射法接種煙草葉片。每株植物注射2～3片葉,每次注射不同載體時應更換手套和注射器,防止交叉污染。同時使用帶pTRV1和pTRV2空載體的農桿菌組合作為VIGS實驗的負對照。注射后的幼苗在溫室里繼續培養,大約1～2周基因沉默所致表型應該開始出現,注意觀察。

3 實驗結果

3.1 pTRV2-NbPDS VIGS載體的構建

首先在擬南芥基因組數據庫(www.arabidopsis.org)中獲得擬南芥番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)的蛋白序列(AT4G14210.1),根據同源序列比對在公布的本氏煙草基因組數據庫(http://solgenomics.net)中獲得本氏煙草的番茄紅素脫氫酶cDNA序列(NbS00014185g0010.1),將其命名為NbPDS。根據本氏煙草的番茄紅素脫氫酶cDNA序列設計引物從本氏煙草cDNA中進行基因擴增。引物序列:F-“ATCGAGCTGAATGAGGATGG”R-“CCGAAATTTCATCAGGGAAA”。PCR擴增得到目的基因片段長度為424 bp,與預期一致。通過連接pEASY-T1載體,菌落PCR陽性鑒定和測序驗證以后,酶切下來的DNA片段進一步構建pTRV2-NbPDS 。構建好的載體轉入農桿菌,進行陽性鑒定和測序,測序結果與發表的基因序列一致,可以用于侵染煙草植株。

3.2 NbPDS基因沉默結果

注射接種病毒10～14 d后,侵染重組病毒pTRV2-NbPDS的植株新長出的葉片出現光漂白現象,白化首先在靠近葉柄處出現，子葉幼嫩,然后從葉脈向邊緣擴展,3周后部分葉片和莖段幾乎完全白化,而對照植株葉片沒有此現象(見圖1)。葉片白化是NbPDS基因沉默后的表型,說明VIGS體系已經建立。

4 結論

本實驗建立了煙草脆裂病毒為載體的VIGS系統,抑制NbPDS基因在本氏煙草中的表達,快速、直觀地看到植物葉片的白化現象,可以幫助學生很好地理解植物RNAi過程,并掌握VIGS這一近年來新開展的技術方法。實驗過程中需要注意的問題如下:

圖1 本氏煙草中病毒誘導的基因沉默體系的建立

首先是幼苗的選擇,實驗表明利用萌發3～4周、具有4～6片真葉的幼苗進行侵染獲得的效果最佳；其次是待注射農桿菌液的濃度,OD600值為1.0左右是比較合適的,太高則病毒毒性太大,植株病毒感染癥狀重,太低則達不到誘導效果；另外需要注意防止交叉污染,每次注射不同菌液時應更換手套和注射器。

本實驗是為北京大學生命科學學院生物技術專業本科生開設的專業實驗課中的改革創新內容。與傳統研究植物功能的方法相比,VIGS具有時間短、效率高的優點,適合于引入教學實驗,并有助于進一步的教學實驗內容改革更新,如后續可以引入RT-PCR檢測目的基因的表達量等實驗。VIGS是當前植物基因功能研究中比較常用的新技術方法,將其轉化為適合本科生實驗教學的內容,對于擴展學生創新思維、提高科研能力有很好的幫助。

References)

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Experimental design and practice for plant gene function analysis by VIGS

Hou Qiaoming, Zhang Li, He Xinqiang, Ding Qi

(Teaching Center for Experimental Biology,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China)

VIGS is a recently developed approach for the gene function analysis in plant. Virus vectors with target gene being transformed into the plant can result in the endogenous gene expression silent,followed with the loss of corresponding function in plant. VIGS technology uses this mechanism to silence plant genes in order to determine their function.Phytoene desaturase (PDS) gene fragment is cloned into tobacco rattle virus vector (TRV) to obtain pTRV-PDS. The construction is transformed intoAgrobacteriumGV3101 and then infectedN.benthamiana. Silencing of thePDSgene inN.benthamianacan result in the white leaf due to photo-bleaching,indicating successful establishment of the VIGS system. Introduction of VIGS,the current hot research, into the experimental teaching is beneficial to expanding the students’ scientific field.

VIGS; RNAi; tobacco rattle virus vector (TRV); Phytoene desaturase (PDS)

2015- 01- 15

侯巧明(1972—),女,黑龍江,博士,工程師,從事生物技術和分子生物學實驗教學.

E-mail：qiaoming@pku.edu.cn

G642.0

A

1002-4956(2015)9- 0191- 03