G250mAb 修飾的腫瘤細胞靶向基因載體功能研究

李 廷，徐 濤，張延輝，劉春雷

（1.青島市婦女兒童醫院，山東266000；2.青島市中心醫院，山東266000）

G250mAb 修飾的腫瘤細胞靶向基因載體功能研究

李 廷1，徐 濤2，張延輝2，劉春雷2

（1.青島市婦女兒童醫院，山東266000；2.青島市中心醫院，山東266000）

目的分析G250mAb與聚乙烯亞胺（PEI）偶聯作為腫瘤靶向基因載體系統的優越性，為腫瘤細胞靶向基因治療提供研究基礎。方法通過二硫鍵將G250mAb與PEI偶聯，得到修飾后的基因載體G250mAb-PEI，利用體外轉染細胞的方法研究其轉基因的優越性。結果G250mAb-PEI轉染效率明顯高于單純PEI或傳統脂質體轉染；其毒性也較未修飾的PEI低；對人宮頸癌細胞Hela的基因轉染具有顯著的靶向性，其轉基因效率是肝癌細胞HepG2（G250陰性）的2倍，而對正常血管平滑肌細胞的基因轉染效率較Hela低近20倍。結論G250mAb-PEI是一種高效、低毒和具有靶向性的基因載體。

Hela細胞； 聚乙烯亞胺； 遺傳載體； 腫瘤/病理學； 基因； 轉染； G250mAb

基因治療的發展出現障礙，最主要的問題是如何有效地將基因釋放到靶細胞中長期穩定地表達，同時較少產生不良反應，即載體效率、靶向性和安全性[1]。高分子基因傳遞系統曾取得較大進展，結構簡單的高分子很難使DNA穿越細胞內的所有屏障，設計多成分、多性能載體將是高分子基因治療的研究方向[2]。單克隆抗體用于提高腫瘤治療的靶向性具有重要意義。自創立單克隆抗體制備技術以來，單克隆抗體的研制與應用使靶向藥物迅速發展[3-4]，對腫瘤靶向治療具有重要意義。目前研制的抗腫瘤靶向藥物大部分屬于單抗制品或以單抗為靶向載體的免疫偶聯物，其中，單克隆抗體與靶細胞行抗原-抗體特異性結合，使藥物或放射性核素釋放的射線損傷與抗體結合的靶細胞DNA，從而發揮抗腫瘤作用[5]。目前單抗在腫瘤的靶向治療領域有著重要的地位[6]。G250是膜相關性的碳酸酐酶，在腫瘤的發生、發展中起重要作用。腎癌G250抗原有良好的腫瘤特異性，其在腎癌細胞中的特異表達使其成為腎癌診斷和治療的重要靶位。本文將G250mAb與聚乙烯亞胺（PEI）偶聯，選用人宮頸癌細胞Hela（G250陽性）和人肝癌細胞HepG2、大鼠平滑肌細胞（SMC，G250陰性），利用體外細胞培養技術，檢測G250mAb修飾的PEI對Hela細胞基因轉染的靶向性。

1 材料與方法

1.1 材料 PEI枝化型（相對分子質量為25 000）、N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫）丙酸酯（SPDP）和2-咪唑硫烷均來自美國Sigma公司；轉染試劑盒（LipofectamineTM2000）來自美國Invitrogen公司；小鼠成纖維細胞（NIH3T3，武漢大學）；人宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞HepG2（本實驗室保存）；大鼠平滑肌細胞SMC；噻唑藍（MTT，生化純，Gibco公司）；二甲亞砜（DMSO，分析純，天津市化學試劑三廠）；DMEM（美國Gibco公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE TE2000U，日本）；酶標儀（Labsystem，Muhiskan，Ascent，芬蘭）。

1.2 方法

1.2.1 質粒擴增和純化 質粒pEGFP-C1在大腸桿菌中擴增，使用Qiagen plasmid Maxiprep試劑盒按照產品操作說明分離、提取和純化質粒。利用凝膠電泳和紫外-可見分光光度計（UA）檢驗并測定所提取的質粒DNA的純度和濃度，然后將DNA在TE緩沖溶液（含0.1mol/L氯化鈉、0.01 mol/L三羥甲基氨基甲烷，pH=8.0）中稀釋，于-20℃保存。

1.2.2 G250mAb與PEI復合物的合成 向5 mL PEI的磷酸鹽緩沖液（PBS，濃度5 mg/mL）中加入20 μL的SPDP（10 mmol/L DMSO溶液），混合物在室溫下避光反應30 min，加入100 μL 1 mol/L的甘氨酸溶液終止反應。在室溫下G250mAb溶于1 mL冷PBS，然后加入21.8μL 20 mol/L的2-咪唑硫烷活化，混合物在室溫下避光反應30 min，加入50 μL 1 mol/L的甘氨酸溶液終止反應，然后與活化的PEI混合，在室溫下繼續反應1 h，將最終產物用Sephadex G-75分離純化，收集產物用蒸餾水透析，冷凍干燥后得到G250mAb-PEI靶向載體。

1.2.3 體外轉染試驗篩選轉染G250陽性細胞Hela效率最佳的產物 G250mAb與PEI之間的質量比例影響著二者偶聯系統的轉染率，通過體外轉染試驗篩選轉染G250陽性細胞Hela效率最佳的產物。轉染前24 h在24孔培養板中種入Hela細胞，密度約為每孔20 000個細胞，G250mAb-PEI（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600）與DNA以不同的質量比轉染G250陽性細胞Hela，48 h后在熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況。

1.2.4 基因載體轉染效率測定 選擇Hela和HepG22種常見腫瘤細胞，前者表達G250，而后者不表達G250。用正常細胞SMC作為對照組。轉染前24 h在24孔培養板中分別種入HepG2、Hela細胞，密度約為每孔20 000個細胞。每孔加入0.5 mL完全DMEM培養基，5%CO2培養箱中37℃培養。轉染前先移去完全培養基，用溫熱PBS洗滌細胞。用0.5 mL無血清DMEM培養基繼續培養。在溫和渦旋攪拌下，G250mAb-PEI與DNA以質量比3∶1混合，PEI與DNA以質量比1∶1混合，脂質體LipofectamineTM2000與DNA以3∶1混合，孵育30 min，將復合物溶液均勻地加入到各孔中，37℃轉染4～6 h后將無血清培養基換成0.5 mL完全DMEM培養基繼續培養48 h。在倒置熒光顯微鏡下觀測轉染結果。同時，Hela/ SMC：Hela/HepG2培養后行流式細胞儀檢測。

1.2.5 基因載體的細胞毒性測定 將NIH3T3細胞接種到96孔板（1×104/孔），培養24 h后每孔分別加入G250mAb-PEI/PEI/Lipofectamine，使終濃度分別為20、40、60、80、120、160 μg/mL，對照組不加基因載體。培養24 h后每孔加入25 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續孵育4 h，棄去上清液，用PBS清洗1次，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶標儀在570 nm波長下測定吸光度。每個濃度及對照組做6個平行樣，實驗重復3次。根據下列公式計算細胞的相對成活率：相對成活率=樣品組平均吸光度值/對照組平均吸光度值×100%。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 G250mAb與PEI復合物的合成 G250mAb與PEI的反應為PEI過量反應，反應體系中除G250mAb-PEI外，還有過量的PEI和化學小分子。根據其相對分子質量大小的不同，利用分子篩原理進行SephadexG-75分離純化，見圖1。

圖1 G250mAb與PEI復合物合成分離純化

2.2 通過體外轉染試驗篩選轉染G250陽性細胞Hela效率的最佳產物 G250mAb對PEI的不同修飾度影響載體對Hela細胞的轉染效率，其中G250mAb-PEI（1∶400）轉染效率最高，其他比例的產物較之均偏低。經過篩選得到G250mAb-PEI 1∶400在該實驗合成比例中為最佳載體，見圖2。

圖2 G250mAb-PEI轉染效率熒光照片（100×）

2.3 基因載體轉染效率測定 G250修飾的PEI對Hela細胞基因轉染具有靶向性。G250mAb-PEI對Hela/SMC和Hela/HepG2的轉染率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 體外轉染Hela、HepG2、SMC細胞熒光照片（100×）

圖4 共培養的Hela/SMC、Hela/HepG2細胞流式細胞儀檢測結果

2.4 基因載體的細胞毒性測定 G250mAb修飾后載體的生物相容性顯著提高，對NIH3T3細胞的細胞毒性顯著低于PEI、Lipofectamine，見圖5。

圖5 G250mAb-PEI轉染NIH3T3細胞毒性MTT分析

3 討 論

病毒載體轉染效率高，但缺點是安全性較差，且其免疫原性高，所以在體內應用不廣。而非病毒載體安全性較高，免疫原性也較低，將成為首選的基因轉染載體[7]。PEI還可以合成更復雜的DNA非病毒載體釋放系統，用于體內基因治療。Koo等[8]發現，PEI能轉染真核細胞基因，但能引起紅細胞聚集和溶血，使體內轉染效率大大降低[9]。PEI作為基因載體的缺點還包括高毒性和不可降解性，可以通過PEG、脂質體或細胞特異配體等方法把PEI/DNA復合物屏蔽，從而降低PEI的細胞膜毒性，增強載體的靶向性。G250mAb通過二硫鍵將PEI與G250mAb偶聯，可以特異性結合原發性腎癌和轉移性腎癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌等表面的G250抗原[10]，從而合成G250mAb-PEI基因載體。既實現了用細胞特異性配體降低PEI的細胞膜毒性，又增強了G250mAb與PEI的協同靶向性。本實驗證明，G250mAb-PEI對Hela細胞的轉染效率是SMC轉染效率的19倍。對于Hela細胞，G250mAb-PEI的轉染效率較未修飾的PEI高1倍，而對SMC的轉染效率二者差別不大。結果表明，G250mAb-PEI/DNA復合物能夠與G250抗原緊密結合，促進細胞胞吞，使轉染效率得到提高。相關文獻報道，PEI與NIH3T3細胞作用24h后，根據MTT試驗計算生存率，PEI濃度為6 μg/mL時，細胞生存率為64.2%，在相同的條件下，G250mAb-PEI細胞生存率為82.0%，當其濃度大于6μg/mL時，PEI轉染的細胞生存率急劇下降，在25 μg/mL時降到10%左右，而G250mAb-PEI濃度在6～25 μg/mL時細胞生存率保持在60%～80%，為G250mAb-PEI在體內實驗中的應用提供了廣闊的空間[11]。證明G250mAb-PEI是一種毒性低、效率高、靶向性強的基因載體，為腫瘤細胞靶向基因治療提供了一個很好的轉染途徑。針對PEI的細胞毒性，近年來也有學者利用PEG和細胞特異性配體共同修飾PEI[12-13]，例如G250mAb、PEG共同修飾載體后，細胞毒性降低，生物相容性提高，對NIH3T3細胞的細胞毒性顯著低于PEI，使PEI的高毒性和不可降解性大大降低。

綜述所述，G250mAb-PEI是一種高效、低毒且具有靶向性的基因載體。

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Study on vector function of G250 mAb modified tumor cell target gene

Li Ting，Xu Tao，Zhang Yanhui，Liu Chunlei
（1.Qingdao Municipal Women and Children Hospital，Qingdao，Shandong 266000，China；2.Qingdao Municipal Central Hospital，Qingdao，Shandong 266000，China）

ObjectiveTo research and analyze the superiority of G250mAb coupling with polyethyleneimine（PEI）as a tumor-targeted gene vector to lay the foundation for targeted gene therapy of tumor cells.MethodsG250mAb was coupled with PEI by the disulfide bond for obtaining the modified gene vector G250mAb-PEI.The transfected cells in vitro method was applied to study its transgenetic superiority.ResultsThe transfection efficiency of G250mAb-PEI was significantly higher than that of pure PEI or traditional lipofectamine trasfection；its toxicity was lower than that of non-modified PEI；the gene transfection of cervical cancer Hela cells had significant targeting and its transfection efficiency was twice that of liver cancer cells HepG2（G250 negative），but the transfection efficiency of normal vascular smooth muscle cells（SMC）was lower than that of Hela by nearly 20-fold.ConclusionG250mAb-PEI is a highly efficient gene vector with low cytotoxicity and targeting effect.

Hela cell； Polyethyleneimine； Genetic vectors； Neoplasms/pathology； Genes； Transfection；G250mAb

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.002

:A

:1009-5519（2015）12-1764-03

2015-02-08）

青島市衛生科技發展計劃項目（WSZD080）。

李廷（1981-），女，山東青島人，碩士研究生，主要從事腫瘤的診斷及治療工作；E-mail：qingdaoliting@163.com。

劉春雷（E-mail：qdzxyymnwk@163.com）。