無核葡萄及其雜交組合胚挽救技術

王慶蓮， 吳偉民， 趙密珍， 錢亞明， 夏 瑾

(江蘇省農業科學院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

無核葡萄無論用于鮮食、制干或制罐，深受世界消費者的青睞，有著廣闊的市場前景，因此培育大粒、無核葡萄是當今世界葡萄育種的重要目標之一。絕大多數的無核葡萄品種類型屬于種子敗育型，即受精卵形成的合子胚在發育過程中發生敗育，以致于在果實成熟時只留下殘跡，導致以無核品種作母本則很難得到可發育成苗的種子［1］。20世紀80年代以前的無核品種育種是以有核品種作母本、無核品種作父本的有性雜交獲得，其后代的無核幾率很低，只有0～15.9%［2-5］，這嚴重地影響了無核葡萄育種的效率;80年代以后隨著生物技術的發展，1982年Ramming等改變了傳統的育種模式，首次使用胚珠培養技術獲得了兩株無核葡萄苗，創立了無核葡萄胚挽救技術［6］。1990年Ramming等通過研究再次發現無核葡萄胚珠培養獲得的雜種植株中有82%表現為無核性狀［7］。之后，國內外研究者相繼利用胚挽救技術創建了大量的無核葡萄新種質［8-21］，使得無核葡萄育種中以無核品種作母本的雜交成為現實，極大地提高了后代的無核比例，而且比常規傳統雜交技術節省了時間，提高了育種的效率，因此胚挽救技術可以被認為是無核葡萄育種的最有效方式之一［22-23］。但由于受基因型和離體培養條件的影響，葡萄幼胚離體發育和萌發成苗率低仍然是制約無核葡萄育種的關鍵限制因素。

本研究在前人研究的基礎上，采用正反交試驗設計，進一步研究無核葡萄品種及其雜交組合胚挽救過程中胚珠培養成苗的親本親和性，探索適宜胚珠萌發的培養基成分與激素濃度、接種時期和胚珠處理方式，建立適用于這些親本組合的高效無核葡萄胚挽救技術體系，為今后的無核葡萄育種提供指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料來源于江蘇省農業科學院園藝研究所葡萄試驗園內正常的葡萄植株，常規管理。

以自然授粉的無核葡萄莫利莎無核和希姆勞特及其去雄授粉的正反交雜交組合莫利莎無核×希姆勞特、希姆勞特×莫利莎無核為試驗材料，分別采集授粉后4周、5周、6周、7周、8周和9周的葡萄果穗，置于4℃冰箱保存備用。于2011年5月至2012年12月在江蘇省農業科學院園藝研究所生物技術室進行試驗。

1.2 方法

采集授粉后不同周數的葡萄果穗，將其果粒用清水沖洗數次，然后在無菌超凈工作臺上用75%酒精消毒30～60 s，再用15%次氯酸鈉溶液消毒15～20 min，最后用無菌水沖洗3次。將消毒后的果粒切開，取出胚珠，接種于江蘇省農業科學院園藝研究所漿果研究室已經建立的pH 5.8的胚珠發育培養基(Nitsch培養基+IAA 2.0 mg/L+GA30.4 mg/L +水解酪蛋白質100.0 mg/L+活性炭2.0 g/L+瓊脂6.5 g/L+蔗糖20.0 g/L)［24］。在溫度為 (25± 1)℃條件下進行暗培養。培養60 d后統計胚珠發育率，將綠色胚珠作為發育胚珠統計。計算公式為:胚珠發育率 =(綠色胚珠數量/接種胚珠數量)×100%。

1.2.1 培養基種類和6-BA激素濃度對胚珠萌發的影響 以自然授粉后7周的莫利莎無核葡萄果粒胚珠為試驗材料，將胚珠發育培養基上暗培養60 d的綠色胚珠進行橫切處理后轉入不同的胚珠萌發培養基中進行萌發培養。

胚珠萌發培養的基本培養基種類選用1/2 MS、Nitsch、B5和WPM，植物生長激素6-BA濃度梯度為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L和 1.0 mg/L，在附加50.0 mg/L水解酪蛋白質、3.0 g/L活性炭、6.5 g/L瓊脂和20.0 g/L蔗糖的培養基(pH 5.8)上進行萌發培養。培養條件為溫度 (25±1)℃、日照時數15 h、光照度2 000 lx，30 d后統計胚珠萌發率。計算公式為:胚珠萌發率=(萌發胚珠數量/接種胚珠數量)×100%。每處理接種3～6瓶，每瓶接種20～25枚胚珠。

1.2.2 胚珠處理方式對其萌發的影響 以自然授粉后7周的莫利莎無核葡萄果粒胚珠為試驗材料，選擇胚珠發育培養基上暗培養60 d的綠色胚珠，采用切喙、橫切、剝取裸胚等處理方式，轉入1.2.1方法篩選出的胚珠萌發培養基(WPM培養基+6-BA 0.2 mg/L+水解酪蛋白質50.0 mg/L+活性炭3.0 g/L+瓊脂6.5 g/L+蔗糖20.0 g/L)上進行萌發培養，培養條件為溫度(25±1)℃、日照時數15 h、光照度2 000 lx，30 d后統計胚珠萌發率。計算公式為:胚珠萌發率=(萌發胚珠數量/接種處理胚珠數量)×100%。每處理接種3～6瓶，每瓶接種20～25枚胚珠。

1.2.3 取樣時期對胚珠發育和萌發的影響 將不同取樣時期(授粉后4周、5周、6周、7周、8周和9周)的無核葡萄莫利莎無核和希姆勞特及其正反交雜交組合的胚珠發育培養60 d的綠色胚珠橫切處理后轉接到1.2.1方法篩選出的胚珠萌發培養基(WPM培養基+6-BA 0.2 mg/L+水解酪蛋白50.0 mg/L+活性炭3.0 g/L +瓊脂6.5 g/L +蔗糖20.0 g/L)上進行萌發培養。培養條件為溫度(25±1)℃、日照時數15 h、光照度2 000 lx，30 d后統計胚珠萌發率。計算公式為:胚珠萌發率=(萌發胚珠數量/接種胚珠數量)×100%。每處理接種3～6瓶，每瓶接種20～25枚胚珠。

1.3 數據分析

試驗數據采用 Microsoft office excel 2007和SPSS 11.0軟件進行統計及分析。

2 結果與分析

2.1 培養基種類和6-BA濃度對胚珠萌發的影響

培養基種類和植物生長激素6-BA濃度對授粉后7周的莫利莎無核葡萄胚珠萌發的影響結果見表1。由表1可以看出，不同的培養基種類對莫利莎無核葡萄胚珠萌發的影響不同，其中WPM基本培養基的平均萌發率最高，為18.63%，分別是1/2 MS、B5和 Nitsch基本培養基平均萌發率的3.79倍、2.62倍和1.66倍，這說明WPM培養基是適合莫利莎無核葡萄胚珠萌發的最佳培養基類型。

由植物生長激素6-BA濃度對莫利莎無核胚珠萌發的影響(表1)可以看出，在以1/2 MS為基本培養基的胚挽救試驗中以添加0.5 mol/L 6-BA的胚珠萌發率最高，為9.28%;在以B5和WPM為基本培養基的胚挽救試驗中均以添加0.2 mol/L 6-BA的胚珠萌發率最高，分別為 11.21%和32.99%;而在以 Nitsch為基本培養基的試驗中0.4 mol/L 6-BA 的胚珠萌發率為最高，為18.56%。同時，還可以看出，以WPM為基本培養基且添加0.2 mol/L 6-BA的胚珠萌發率均高于以1/2 MS、Nitsch和B5基本培養基添加不同6-BA濃度的胚珠萌發率。

綜上所述，選用WPM為基本培養基、添加0.2 mol/L 6-BA并附有50.0 mg/L水解酪蛋白質、3.0 g/L活性炭、6.5 g/L瓊脂和20.0 g/L蔗糖是莫利莎無核葡萄胚珠萌發的最佳培養基組分。

2.2 胚珠處理方式對胚珠萌發的影響

不同胚珠處理方式對授粉后7周的莫利莎無核葡萄胚珠萌發的影響結果見表2。由表2可以看出，與發育胚珠直接轉接相比，不同的胚珠處理方式均可以提高莫利莎無核葡萄胚珠的萌發，其中剝胚和橫切處理的萌發率最高，分別比直接轉接的胚珠萌發率顯著提高了4.03倍和5.17倍;其次是縱切處理的萌發率，比直接轉接的顯著提高了1.55倍;切喙處理雖可以提高胚珠的萌發率，但是與直接轉接的胚珠萌發率相比差異不顯著。

表1 培養基種類和6-BA濃度對胚珠萌發的影響Tbale 1 Effect of culture medium varieties and 6-BA concentrations on the ovule germination

表2 胚珠處理方式對胚珠萌發的影響Tbale 2 Effect of different ovule treatments on ovule germination

2.3 取樣時期對胚珠發育及萌發的影響

取樣時期對無核葡萄及其正反交雜交組合胚珠發育和萌發的影響見表3，從表3可以看出，授粉后不同周數(4周、5周、6周、7周、8周和9周)的無核葡萄莫利莎無核和希姆勞特及其正反交組合莫利莎無核×希姆勞特和希姆勞特×莫利莎無核，不同取樣時期的大部分胚珠都能發育，但胚珠萌發的差異較大。

表3 取樣時期對無核葡萄品種及其正反交組合離體胚珠培養的影響Table 3 The effect of sampling dates on the embryo germination of in-vitro cultured ovules in seedless grapes and their reciprocally crossed progenies

從自然授粉的莫利莎無核葡萄不同取樣時期的胚珠培養結果(表3)可以看出，授粉后不同取樣時期的胚珠均能發育和萌發，且其胚珠發育和萌發隨著取樣時期的延長呈現相同的變化趨勢，即先升高后降低。其中，授粉后7周的胚珠發育率和萌發率均為最高，分別為69.23%和35.58%;授粉后6周的胚珠發育率和萌發率次之，分別為56.03%和 27.59%;而授粉后4周的胚珠發育率和萌發率均為最低，分別比授粉后7周的低39.57個百分點和個百分點。這說明授粉后7周是莫利莎無核葡萄胚挽救的最佳取樣時期。

從自然授粉的希姆勞特葡萄不同取樣時期的胚珠培養結果(表3)可以看出，授粉后不同取樣時期的胚珠均能發育，其中授粉后5周的胚珠發育率最高(為45.58%)，授粉后6周的胚珠發育率次之，比授粉后5周的低6.24個百分點，之后隨著取樣時間的延長其胚珠發育率逐漸下降;授粉后不同取樣時期的胚珠除授粉后9周的沒有萌發外，其余不同取樣時期的均能萌發，并以授粉后6周的萌發率為最高(為18.67%)，而且比授粉后5周的胚珠萌發率高4.38個百分點，授粉后7周的次之。由此看出，授粉后6周可以作為希姆勞特葡萄胚挽救的最佳取樣時期。

從莫利莎無核×希姆勞特雜交組合不同取樣時期的胚珠培養結果(表3)中看出，該雜交組合在不同取樣時期的胚珠均能發育和萌發，而且其胚珠萌發率的變化趨勢與其胚珠發育率相同，即在授粉后4～9周的取樣時期中，隨著取樣時期的延長其胚珠萌發率和發育率逐漸升高，之后逐漸降低。其中，授粉后4周的胚珠發育率和萌發率均為最低，分別為22.45%和2.04%;而授粉后7周的胚珠發育率和萌發率均為最高，分別是授粉后4周的胚珠發育率和萌發率的3.01倍和16.21倍。因此，授粉后7周取樣是該無核雜交組合的最佳取樣時期。

從希姆勞特×莫利莎無核雜交組合不同取樣時期的胚珠培養結果(表3)中看出，授粉后不同取樣時期的胚珠均能發育和萌發，但是其胚珠發育和萌發的變化趨勢不一致，其中授粉后7周的胚珠發育率最高，授粉后8周的次之，分別為61.48%和52.59%;然而胚珠萌發率以授粉后8周的為最高，其次是授粉后7周的，分別為26.72%和19.67%。胚挽救技術是以幼胚敗育前通過離體培養使其萌發成苗為目的，因此對于該雜交組合應選擇授粉后8周作為胚挽救的最佳取樣時期。

此外，由表3還可以看出，自然授粉的莫利莎無核葡萄的胚珠平均發育率和平均萌發率均為最高，分別為49.53%和33.88%;莫利莎無核×希姆勞特雜交組合的平均發育率和平均萌發率次之;希姆勞特葡萄的均為最低，分別比希姆勞特×莫利莎無核雜交組合的胚珠發育率和萌發率低8.26個百分點和2.75個百分點，說明自然授粉的莫利莎無核葡萄及其正反交雜交組合的平均萌發率均高于自然授粉的希姆勞特葡萄。

3 討論

胚挽救技術已經成為無核葡萄育種最有效的方式之一，在無核葡萄胚挽救技術的影響因素中，培養基是影響胚挽救是否成功的重要因素之一［6］，它可以為離體培養條件下的幼胚提供繼續發育所需的營養物質和激素。本試驗在前人的研究基礎上，以莫利莎無核葡萄為試驗材料，通過研究發現該親本的最佳萌發基本培養基種類為WPM，植物生長激素6-BA的最佳濃度為0.2 mg/L，因此胚珠萌發培養基組分為WPM培養基+6-BA 0.2 mg/L+水解酪蛋白質50.0 mg/L+活性炭3.0 g/L+瓊脂6.5 g/L +蔗糖20.0 g/L。

本研究還發現，對離體發育胚珠進行一定的處理均有助于提高胚珠的萌發出苗，這與趙密珍等［24］、蔣愛麗等［25］和夏培蓓等［26］在不同的無核葡萄品種胚挽救技術中的研究結果一致。本研究發現剝胚的萌發率最高，橫切次之，但是由于無核葡萄的種胚較小，剝胚處理難度較大，在剝離過程中極容易受到損傷，而且剝胚后的胚發育與橫切的相比較為緩慢。橫切處理方法簡單易操作，對胚傷害較小，橫切處理后的胚也能夠在胚乳和培養基的雙重營養下萌發生長。此外，從本試驗數據中看出，剝胚處理的胚珠萌發率雖然比橫切處理的高8.19%，但二者之間的差異不顯著。因此，采用橫切處理是促進胚珠萌發最合理的處理方式。

董曉玲在早玫瑰和新玫瑰葡萄胚的研究中發現，胚的發育過程為多細胞原胚-球形胚-心型胚-魚雷型胚-子葉型胚-成熟種子［27］。之后，很多研究者發現心型胚中后期至魚雷期是無核葡萄胚接種的最佳時期［28-30］。王躍進等認為所有種子敗育型無核葡萄的合子胚都有一個急劇敗育時期［31］，但不同種子敗育型無核葡萄品種的合子胚發育程度和敗育時期是不同的［11，17］。因此，取樣接種時期也是影響無核葡萄胚挽救的重要因素。本研究結果顯示，無核葡萄莫利莎無核、希姆勞特及其正反交雜交組合的最佳取材接種時期不同，其中莫利莎無核葡萄的最佳取樣時期為授粉后7周，希姆勞特為授粉后6周，莫利莎無核×希姆勞特雜交組合為授粉后7周，希姆勞特×莫利莎無核雜交組合為授粉后8周。從不同品種及其不同雜交組合最佳取樣時期的胚珠發育率和萌發率指標可以看出，莫利莎無核葡萄的胚珠發育率和萌發率最高，而希姆勞特葡萄的均為最低。此外，希姆勞特×莫利莎無核雜交組合胚珠發育率和萌發率也低于莫利莎無核×希姆勞特雜交組合，這可能與希姆勞特葡萄的胚珠較小、營養不足等有關［32］，這也充分表明母本對胚珠萌發起著關鍵作用。因此，在無核葡萄胚挽救技術育種實踐中，應當根據不同的親本及其雜交組合進行不同的優化研究。

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