基于辣椒基因組重測序的InDel標記開發及應用

郭廣君， 孫 茜， 劉金兵， 潘寶貴， 刁衛平， 戈 偉， 高長洲， 王述彬

(江蘇省農業科學院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

辣椒(Capsicum spp.)屬于茄科 (Solanaceae) 辣椒屬(Capsicum)作物，作為一種重要的蔬菜作物和調味品，廣泛栽培于南北美、亞洲、歐洲和大洋洲等世界各地。隨著消費者需求的多樣性，利用傳統方法在辣椒的遺傳改良上取得了很大進展，但是分子標記［1］和第二代測序技術［2］的出現為辣椒的遺傳改良提供了更大的機遇［3］。目前辣椒分子標記的開發和應用主要集中于利用公用數據或者基因組文庫開發SSR標記［4-8］。隨著高通量測序技術的發展和辣椒基因組數據的發布，使得辣椒分子標記的開發和應用進入了一個新的階段［9-10］，第三代分子標記SNP標記和InDel標記的開發和應用在辣椒中逐漸廣泛［11-14］。

插入/缺失多態性(Insertion/deletion，InDel)標記是由于等位基因位點處的DNA序列在不同個體間發生了核苷酸片段的插入/缺失而產生的長度多態性變異［15］。根據目標位點兩側的序列設計特異引物進行PCR擴增，擴增片段的長度多態性即是InDel標記。在整個基因組中，InDel標記的多態性頻率僅次于SNP標記，遠高于SSR標記。InDel標記多態性可通過聚合酶鏈式反應(PCR)和瓊脂糖凝膠電泳或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等簡單的步驟達到基因分型的目的［16-17］，相對于SNP標記，其標記的設計和檢測更為簡易，應用也更為方便［18］。此外，InDel標記的另一優點是不可能在同1個基因組位點上發生同樣長度的2個 InDel位點突變，所以具有共同InDel突變位點的2個物種間代表其具有血緣一致性(Identity-by-descent)［19］。綜上所述，In-Del標記為共顯性標記，具有較好的穩定性和較為豐富的多態性，是高分辨率圖譜構建，關聯分析和基因定位等方面最佳的候選標記［20］。但是，辣椒中已開發和應用的InDel標記數量非常少，本研究的目的在于基于辣椒基因組重測序數據開發InDel標記，利用不同遺傳背景的辣椒種質對開發出的InDel標記進行驗證，篩選獲得有效的InDel標記，進一步探討InDel標記在種質鑒定中的應用。

1 材料與方法

1.1 InDel位點的挖掘

本研究利用重測序數據與參考基因組進行比對查找InDel位點。參考基因組版本為pepper.V.1.55，下載網址:http://peppergenome.snu.ac.kr/ download.php。采用illumina HiSeqTM2500測序平臺對一年生辣椒(Capsicum annuum)“G29”和灌木狀辣椒(Capsicum.frutescents)“G108”進行測序。將測序得到的原始Reads進行質量評估并過濾得到Clean Reads。利用bwa軟件比對定位Clean Reads在參考基因組上的位置。InDel的檢測主要使用GATK軟件工具包實現。根據Clean Reads在參考基因組的定位結果，使用 Samtools進行去重復(Mark duplicates)，使用GATK軟件進行局部比對(Local realignment)和堿基質量值校正(Base recalibration)等預處理，以保證檢測結果的準確性，再使用GATK軟件進行變異檢測和校準，選取可靠的In-Del位點［21-22］。利用SnpEff軟件根據InDel位點在參考基因組上的位置信息，對比參考基因組的基因、CDS位置等信息對其進行注釋和預測其影響。

1.2 InDel引物設計和分析

根據重測序數據中預測到InDel位點，篩選出插入/缺失堿基數為5～10個堿基的位點。基于辣椒基因組序列，將篩選出的位點定位在基因組上，取InDel位點兩翼各200 bp堿基長度，共401 bp長度進行引物設計。采用Primer 3.0進行引物設計，上游引物設計范圍在1～195 bp，下游引物設計范圍為205～401 bp，產物大小為150～250 bp，退火溫度為52～60℃。

優化后的擴增反應采用10 μl反應體系，包括20 ng模板DNA、5 μl 2×Mix混合液(含Mg2+的10×PCR buffer、2.5 mmol/L的 dNTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶)、每個引物終濃度為0.2 μmol/L。反應程序為94℃預變性4 min;94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸40 s，循環30次;72℃延伸7 min，置于4℃下保存。擴增產物用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，統計分析條帶類型。

1.3 供試辣椒種質及其DNA提取

用于檢測標記有效性的辣椒材料來源于國外和國內多個科研單位，其中包括一年生辣椒(Capsicum annuum)21份、灌木狀辣椒(Capsicum frutescents)2份，下垂辣椒(Capsicum baccatum)1份。除11份辣椒品種外，其余13份以G開頭的材料為項目組引進的國外種質資源(表1)。采用改良CTAB法提取葉片的基因組DNA［23］，經瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測，DNA濃度調至50 ng/μl備用。

2 結果與分析

2.1 辣椒InDel標記的鑒定

通過與參考基因組序列比對，一年生辣椒品種G29和灌木狀辣椒品種G108的全基因組范圍內共檢測到的InDel數量分別為533 523個和1 664 770個，其中編碼區的InDel數量分別為1 019個和2 515個，具體結果見表2。通過進一步比較分析，G29和G108之間的全基因組范圍內 InDel數量為1 586 427個。

表1 24份供試辣椒種質基本信息Table 1 The information of 24 tested pepper ge rmplasm

表2 全基因組和編碼區InDel位點信息Table 2 The information of InDel loci within the whole genome and CDS

2.2 InDel標記有效性驗證

根據預測的InDel位點，在2號染色體上隨機選擇了40個InDel位點設計引物，引物信息見表3。以24份不同來源的辣椒材料驗證標記的有效性。經過PCR和產物檢測發現，40對引物在24份辣椒材料中均能擴增出條帶，擴增條帶的大小與預測產物大小基本相同。如圖1為引物InDel-2-3對24份辣椒種質PCR擴增結果。經統計，在24份材料中共擴增出70個清晰可辨的位點，其中35個標記表現出多態性，5個無多態性，多態率達到87.5%。

2.3 InDel標記在品種和種質資源鑒定中的應用

利用Popgene32軟件對40對引物在24份辣椒材料中的擴增結果進行分析發現，每對引物反映的基因多樣性指數范圍為 0.08～0.50，其均值為0.20;Shannon′s多樣性信息指數分布在0.17至0.80之間，其均值為0.34(表3)。

利用NTSYSpc 2.10e中的UPGMA方法對24份材料進行聚類分析，由聚類結果(圖2)可以看出，在遺傳相似系數0.42處，24份辣椒種質 分為2個大類，一類為21份一年生辣椒，另一大類為2份灌木狀辣椒(C.frutescens)和1份下垂辣椒(C.baccatum)。21份一年生辣椒中可以聚類為羊角形辣椒、牛角形(長燈籠形)辣椒和甜椒三大類別。同時，聚類結果顯示牛角形(長燈籠形)辣椒和甜椒相似度更高，同一單位品種間相似度高于不同單位間相似度。

表3 本研究開發的辣椒InDel標記信息Table 3 The information of pepper InDel markers developed in the study

圖1 引物InDel-2-3對24份辣椒種質的擴增結果Fig.1 Amplification of 24 pepper germplasm DNA with marker InDel-2-3

圖2 基于Nei′s遺傳距離的24份辣椒種質的UPMGA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 24 pepper germplasm based on the Nei′s genetic distance

3 討論

InDel標記為共顯性標記，具有較好的穩定性和較為豐富的多態性。雖然在整個基因組中，其多態性頻率次于SNP標記［24］，但是，相對于SNP標記，InDel標記在引物設計、多態性檢測等方面更為簡易，應用也更為方便［16-17，25］。但是，目前辣椒中In-Del標記的開發數量較少，應用較為有限，這一現狀急待改善［11］。

本研究基于全基因組重測序數據，通過與參考基因組序列比對，在一年生辣椒品種G29和灌木狀辣椒品種G108的全基因組范圍內檢測到的InDel數量分別為533 523個和1 664 770個。以上結果說明利用全基因組重測序技術可以在辣椒中更好地挖掘InDel位點，為全基因組范圍內的InDel設計提供了更優選擇。這一觀點已經在包括辣椒在內的多個物種中得以驗證［12，26-27］。

利用24份辣椒材料對2號染色體上的40個標記的有效性進行驗證，發現24份材料在40個標記中共擴增出70個清晰可辨的位點，其中35個標記表現出多態性，多態率達到87.5%。這一結果很好地驗證了本研究開發出的InDel標記的有效性和較高的多態性。目前辣椒分子標記的開發和應用主要集中于利用公用數據或者基因組文庫開發SSR標記，但是大部分研究結果表明SSR標記的多態性及其應用率遠低于InDel標記。如Huang等人基于數據庫中的辣椒序列開發出12個SSR標記，其中多態性標記為5個，多態率為41.7%［5］;Lee等構建辣椒分子遺傳連鎖圖譜時開發出76個SSR標記，其中具有多態性的標記為46個，多態率為60.5%［4］;Yi等開發出1 201個EST-SSR標記，其多態性標記只有150個，多態率僅為29.2%［6］;Huang等依據EST序列開發出SSR標記755個，利用8份辣椒栽培種對其中的210個進行驗證，其多態性標記為127個，多態率為60.5%［8］;Shirasawa等基于辣椒EST序列設計了5 751個SSR標記，利用辣椒材料對其中77個進行驗證，其中60個表現出多態性，多態率為77.9%［7］。但是，也有少數研究結果顯示，InDel標記與SSR標記的多態率并無明顯差異。Li等利用InDel標記構建辣椒種內遺傳圖譜時顯示，1 000個InDel標記中251個標記可以成功應用于圖譜構建，其多態率為25.1%［11］。隨后，該團隊(2015年)基于SSR和InDel標記構建辣椒種間遺傳圖譜時，分別篩選了1 038個InDel標記和674個SSR標記，其中多態性標記分別為140個和102個，多態率分別為13.5%和15.1%［12］。

利用NTSYSpc 2.10e中的UPGMA方法對24份材料進行聚類分析，結果表明35個InDel標記不僅可以有效區分出21份一年生辣椒、2份灌木狀辣椒和1份下垂辣椒，而且21份材料中又可以聚類為不同種類，其聚類結果與表型特征非常吻合。這一結果表明InDel標記在種質資源的遺傳分析、品種鑒定和品種保護方面具有極大的應用價值。但同一單位育成品種的相似度很高，說明可利用的辣椒種質的遺傳背景較窄，對于品種改良極為不利，需要開發和應用新的種質進行品種的選育和改良。

總的來說，基于全基因組重測序數據開發InDel標記可以有效地應用于辣椒種質鑒定，遺傳圖譜的構建，關聯分析和基因定位等方面，是辣椒種質資源開發利用和分子標記輔助育種的高效工具。

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