鵝輸卵管TLR家族基因差異表達的研究

應詩家， 戴子淳，2， 郭佳佳， 李 輝， 雷明明， 施振旦， 沈明君

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室，江蘇 南京 210014;2.南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095;3.揚州朝天歌農牧科技有限公司，江蘇 揚州 225000)

禽類輸卵管的傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部在種蛋形成過程中具有重要的作用，其陰道部和泄殖腔特有的生理結構極易導致糞便中的病原微生物經陰道沿輸卵管腔感染輸卵管其他部位［1］。此外，種鵝的賴水習性也極易引起養殖水體病原微生物通過交配進入種鵝生殖道，誘發輸卵管炎癥反應，影響種蛋受精率和孵化率［2-3］。因此，種鵝輸卵管自身的非特異性免疫功能對抵御病原微生物侵害至關重要。

Toll樣受體(TLRs)是一類病原識別模式受體，識別病原微生物及其代謝產物，啟動胞內信號級聯效應，誘導非特異性免疫反應，抵御病原微生物侵染［4-5］。已發現的禽類TLR家族包括TLR1-1、TLR1-2、TLR2-1、TLR2-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21共10個基因［6］。這些TLRs的時空表達對識別病原微生物，啟動非特異性免疫反應，維持組織器官功能具有重要的作用。Ozoe等對 TLR1-1、TLR1-2、TLR2、TLR3、TLR14、TLR5和TLR7的研究發現TLR1-1在輸卵管各部位均不表達，TLR2、TLR3和TLR14在陰道、子宮和傘部組織表達顯著高于膨大部［7］。華國洪和劉少豐等分別研究了鵝TLR2-1和TLR15［8］、TLR3和TLR5［9］基因在皮膚、脾臟和法氏囊等11種組織器官中的差異表達。然而，國內外對鵝輸卵管TLR家族基因的研究尚無報道。

本試驗擬系統地研究已發現的10種禽TLR家族基因在產蛋高峰期種鵝輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部的表達變化，為種鵝輸卵管啟動非特異性免疫反應，抵御病原微生物侵染的分子調控機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在揚州朝天歌農牧科技有限公司所屬的瑞農農業專業合作社隨機選擇5只產蛋高峰期揚州鵝，產蛋后8 h(新生蛋運行至子宮部［10］)頸動脈放血屠宰，取輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部以及脾臟組織樣，液氮保存。

1.2 主要試劑

100 bp Marker和 PrimeScriptTMRT Master Mix購自寶生物工程(大連)有限公司，Taq PCR Master Mix購自南京博爾迪生物科技有限公司，astStart U-niversal SYBR Green Master購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，含Dase I的RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 總RNA提取和反轉錄

取小塊傘部、峽部、膨大部、子宮部、陰道部和脾臟組織，按天根試劑盒說明書提取總RNA。RNA質量檢測合格后，參照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書，合成cDNA第1鏈，-20℃保存備用。反應體系為10.00 μl(2.00 μl 5×PrimeScript? Buffer，8.00 μl RNA)。反轉錄程序:37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。

1.5 PCR反應和測序

根據GenBank登錄號，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，其中TLR1-1、TLR1-2和TLR21的引物根據鴨相應的序列信息設計，引物信息見表1，由上海英駿生物技術有限公司合成。

PCR反應體系為10.00 μl:2×Taq PCR Master Mix 5.00 μl，ddH2O 3.50 μl，上游和下游引物各0.25 μl，RT產物1.00 μl。

反應程序為:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，50/57/60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環; 72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物用3%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，由上海英駿生物技術有限公司測序。

表1 定量PCR引物信息Table 1 Primer pairs used for real-time PCR

1.6 Real-time PCR分析

以管家基因β-actin為內參，每個樣品重復3次，取平均Ct值進行計算，所得試驗數據按2-△△Ct結果統計分析。

定量PCR反應體系為20 μl:1.00 μl RT產物，上游引物和下游引物各0.60 μl，7.80 μl ddH2O，10.00 μl FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)。反應程序為:50℃2 min，95℃預變性10 min;95℃變性15 s，50/57/60℃退火30 s，72℃30 s，共40個循環。

1.7 統計分析

數據采用SPSS 13.0軟件統計分析，結果以“平均值 ±標準誤”表示。試驗數據采用單因子方差分析，Duncan法多重比較。

2 結果與分析

2.1 鵝輸卵管TLRs家族基因表達譜

分別采用設計的引物進行RT-PCR擴增，并以脾臟的擴增產物為陽性對照，PCR產物電泳檢測結果與欲擴增目的片段大小一致(圖1)。通過測序，并與GenBank已登錄的序列(表1)比對，相似性達到97%以上，表明PCR擴增片段為鵝TLR家族基因片段。

基因表達試驗結果(圖1)顯示，目前已發現的禽類10種TLR家族基因均在鵝輸卵管中表達，除膨大部未發現TLR1-1表達和子宮部組織未發現TLR5表達外，輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部均表達其他TLR家族基因。

圖1 鵝輸卵管和脾臟TLR1-1家族基因表達譜Fig.1 Gene expression profiling of Toll-like receptors in geese oviduct and spleen tissues

2.2 鵝TLR家族基因在輸卵管不同功能部位的差異表達

鵝TLR家族基因在輸卵管不同功能部位的差異表達見表2。TLR2-2和TLR21在輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部表達差異不顯著(P＞0.05);TLR1-1、TLR3、TLR5和TLR15 4個基因在陰道部高表達;TLR14和TLR5 2個基因在峽部高表達;TLR1-2和 TLR2-1 2個基因在傘部高表達; TLR2-1和TLR7分別在膨大部和子宮部中高表達。

陰道部TLR1-1表達顯著高于傘部(P＜0.05)，TLR3表達顯著高于傘部、峽部和膨大部 (P＜0.05)，TLR5表達顯著高于傘部和膨大部 (P＜0.05)，TLR15表達顯著高于子宮部(P＜0.05);傘部TLR1-2和TLR2-1表達顯著高于峽部和陰道部(P＜0.05);峽部TLR14表達顯著高于子宮部和陰道部 (P＜0.05)，TLR5顯著高于傘部和膨大部(P＜0.05);膨大部TLR2-1表達顯著高于峽部和陰道部(P＜0.05);子宮部TLR7表達顯著高于傘部、峽部、膨大部和陰道部(P＜0.05)。

表2 鵝TLR家族基因在輸卵管不同功能部位的差異表達Table 2 Differential expression of TLRs gene in all segments of geese oviduct

3 討論

非特異性免疫反應是機體抵抗感染性疾病的第一道屏障，而TLR家族基因是非特異性免疫反應的關鍵調節基因［11-12］，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁［13］。目前已發現禽類TLR家族包含10種基因，其中大多數基因在禽類卵巢［6］、輸卵管［7］和睪丸［14］中表達，參與性腺免疫反應，維持性腺功能穩態。本試驗系統研究了10種TLR家族基因在鵝輸卵管不同功能部位的差異表達，結果顯示禽類10種TLR家族基因均在鵝輸卵管中表達，表明鵝輸卵管存在抵御病原微生物侵染的非特異性免疫反應。與雞輸卵管的研究結果類似［7］，TLR1-1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR7均在輸卵管各個功能部位表達，TLR5在鵝輸卵管的子宮部不表達。TLR5具有識別細菌鞭毛蛋白的功能［15］，因此，本試驗的結果也表明家禽和水禽輸卵管非特異性免疫反應存在種間差異，并且鵝輸卵管子宮部識別細菌鞭毛蛋白的能力可能弱于雞的子宮。

禽類的輸卵管極易受多種病原微生物感染，如沙門氏菌［16-17］、支氣管炎病毒［18］和禽流感病毒［19］等，而TLR家族基因可識別廣泛的病原微生物及其代謝產物［20］。研究結果表明TLR1可識別肽聚糖、脂磷壁酸、阿拉伯糖甘露糖脂及酵母和真菌的酵母多糖［15］;TLR2除具有TLR1的識別功能外還可識別革蘭氏陰性菌釋放的LPS［15］;TLR3識別雙鏈RNA，同時可以感受到dsRNA病毒、SSRNA病毒和DNA病毒的感染［15，21］;TLR4識別革蘭氏陰性菌釋放的LPS［6，7，22］;TLR5識別細菌鞭毛蛋白［15］;TLR7識別單鏈RNA［15］;TLR15識別革蘭氏陰性菌;TLR21識別細菌基因組產生的未甲基化CpG DNA序列［20］。因此，鵝輸卵管不同功能部位表達大多數TLR家族基因，可有效識別各類病原微生物及其代謝產物，啟動非特異性免疫反應。本試驗中，TLR家族的4個基因在陰道部高表達，2個基因分別在峽部和傘部高表達，僅1個基因在膨大部和子宮部高表達，說明鵝輸卵管的兩端部位識別病原微生物的能力最強。

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