基于NP基因的新城疫病毒Class I實時熒光定量RTPCR方法的建立及驗證

曹軍平， 王曉泉， 程 漢， 劉曉文， 劉秀梵

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009;2.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300)

新城疫(Newcastle disease，ND)是唯一分布于五大洲的OIE A類傳染病。中國ND疫情十分嚴重，是養雞業發展最直接的威脅［1］，已給家禽生產造成嚴重損失［2］。

新城疫病毒(NDV)是新城疫的病原，屬禽副粘病毒1型(AMPV-1)，有囊膜，基因組為單股負鏈RNA，大小約15 kb，編碼6種蛋白質，包括RNA聚合酶(L)、血凝素-神經氨酸酶蛋白質(HN)、融合蛋白質(F)、基質蛋白質(M)、磷蛋白質(P)和核蛋白質(N)。新城疫病毒分離株根據對雞致病嚴重程度可分為3個主要致病型(毒力型)［2］:Lentogenic株是低致病力型，可造成雞輕微呼吸道或腸道感染;Mesogenic株是中等致病力型，主要引起呼吸系統疾病;Velogenic株是高致病力型，造成高死亡率，基于病理表現被進一步分為嗜神經或嗜內臟型。高毒力型NDV屬于必須報告的OIE A類傳染病，它的發生可導致檢疫和貿易禁運。

NDV只有1個血清型，但根據親緣關系可以劃分為兩大類:Class I、Class II，絕大多數常見的都是Class II，可分成Ⅰ～Ⅹ10個基因型。Class I于2006年被證實存在，當前可被細分為9個基因型(1～9)。Class I所有自然分離株均為無毒株或弱毒株，但有經人工傳代返強的報道，由于其分布廣泛，數量龐大，對養禽業有巨大的潛在威脅［3］。為了更好地了解Class I新城疫毒株的生物學特性，為研究Class I提供參考，建立一種快速特異的檢測方法很有必要。

目前，用雞胚進行病毒分離，然后用新城疫特異性抗體做血凝抑制試驗代表病毒檢測的參考標準［4］。雖然病毒分離是一個敏感和特異性的方法，但由于NDV毒力差異大，低毒和無毒株普遍存在，加之弱毒疫苗的普遍使用，對分離毒株血凝抑制試驗結果必須結合毒力鑒定才能確診，一般需要數天才能完成［1］。更快速毒力分型方法基于逆轉錄聚合酶鏈(RT-PCR)反應后進行瓊脂糖凝膠電泳，RT-PCR產物測序，限制性內切酶分析擴增產物以及使用熒光探針［2］。實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應(RRT-PCR)技術，靈敏度高，特異性好，避免了傳統RT-PCR檢測后處理步驟，節省了試驗時間和材料［2，4-6］。本研究擬建立針對禽新城疫病毒Class I核衣殼蛋白(NP)基因的RRTPCR檢測方法，為快速定量檢測Class I新城疫病毒及進一步明確該病毒對禽的致病作用和致病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒

雞新城疫病毒(NDV)由揚州大學農業部畜禽傳染病重點開放實驗室(BSL-3)分離鑒定和保存(表1)。所有NDVs分別以磷酸鹽緩沖液(PH 7.2) 10-5倍稀釋接種于9～10日齡SPF雞胚尿囊腔，接種后24 h內死亡雞胚舍棄，及時收集24～120 h死亡雞胚尿囊液，-70℃保存備用。禽流感病毒(AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏囊炎病毒(IBDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞痘病毒(FPV)等常見禽病病毒均由揚州大學獸醫學院保存。

1.2 主要試劑和儀器

TaqMan Universal PCR Master Mix Kit為美國ABI公司產品;7300型實時定量PCR擴增儀為美國ABI公司生產。

1.3 引物及探針的設計與合成

根據GenBank上5株Class I NDV NP基因序列，結合揚州大學農業部畜禽傳染病重點開放實驗室分離鑒定測序的8株Class I NDV NP基因序列，GenBank登錄號見表1，選取保守區(靠近5′端)設計引物。采用LASERGENE軟件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA)和Primer Premier 5.0軟件設計和分析引物，合成NDV的1對特異引物及相應的探針，并在NCBI上進行了BLAST比對驗證。擴增片段位于NDV Class I國際標準分離株DE-R49-99 NP基因的800～1 086 bp，長度為287 bp，探針位于 NP基因 970～990 bp。上游引物:5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′(800～819 bp);下游引物:5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′(1 066～1 086 bp);TaqMan探針:5′-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-3′(970～990 bp)。5′端標記的熒光報告基團是 JOE，3′端標記的熒光猝滅基團為TAMRA，探針命名為:CNPIP。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，探針由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 標準品模板的制備

1.4.1 NP基因陽性質粒構建 NP基因保守區764 bp(JS-18-05株［7］)陽性重組質粒由曹軍平構建鑒定并保存，載體為 PCR2.1(Invitrogen，USA)。常規法提取質粒純化后送上海生工生物工程技術有限公司進行序列測定，以確定沒有變異。

1.4.2 標準品模板的稀釋 用紫外分光光度計分別測定陽性重組質粒在260 nm和280 nm處的吸光度，并根據公式計算重組質粒的DNA濃度與純度。將重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1μl 102、103、104、105、106、107、108拷貝作為標準品模板，用于熒光定量PCR反應條件的優化、標準曲線的建立。

1 ml分子拷貝數(個)=DNA質量濃度/DNA分子量

DNA分子量=DNA堿基數×324.5

DNA質量濃度=260 nm吸光度×50×稀釋倍數×6.02×1023

1.5 熒光定量PCR反應標準曲線的建立

用引物擴增NP基因陽性質粒，分別以10倍拷貝系列稀釋的重組質粒為標準品模板，加入探針，采用實時熒光定量PCR試劑盒(ABI公司)進行反應，反應總體積為25 μl。在實時熒光定量PCR儀中檢測熒光信號，分別對引物和探針濃度、循環參數、樣本用量等進行優化。利用隨機軟件進行分析，建立標準曲線。

特異性試驗:以AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常見其他禽病病毒及NDV Class II核酸(表1)和健康雞組織 RNA、水為模板，進行熒光定量PCR。

靈敏度試驗:將陽性重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1 μl 102、103、104、105、106、107、108拷貝作為標準品模板，用于熒光定量PCR反應條件的優化、標準曲線的建立并計算靈敏度。

重復性試驗:批內重復性試驗，即分別取等量的3份不同滴度(1 μl 102拷貝、104拷貝、106拷貝)的重組質粒進行熒光定量PCR檢測，每份樣品做5個重復;批間重復性試驗:取以上3份樣品，在同一反應條件下進行5次獨立的熒光定量PCR檢測。

1.6 驗證試驗

用表1毒株接種 SPF雞胚，收集尿囊液進行血凝試驗(Hemagglutination test，HA)和NDV血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition test，HI)，同時用樣品做RRT-PCR試驗，計算2種方法的符合率。

2 結果

2.1 熒光定量PCR反應條件的優化

通過多個批次的重復試驗，證明在25 μl體系中，探針濃度為 0.5 μmol/L、引物濃度為 0.5 μmol/L、模板量3 μl，退火溫度為60℃時，本底反應最小、Ct值最小、擴增效率最高。將25 μl體系小心放入RRT-PCR儀中，記錄樣本擺放順序，在96孔板內填寫被檢樣品、陽性對照、陰性對照、定量標準品孔，設置反應程序。95℃預變性10 min，然后95℃ 15 s，60℃ 1 min，43個循環。熒光信號的收集及數據的采集定在60℃。將以10倍拷貝系列稀釋的重組NP基因陽性質粒為標準品模板，加入體系中。檢測結束，根據噪音情況設定和調整基線及閾值，并利用隨機軟件進行分析，建立標準曲線。根據熒光曲線和循環數(Ct)判斷結果。

2.2 標準曲線的建立

按上述優化的反應條件 ，取1 μl 102、103、104、105、106、107、108拷貝濃度的重組質粒作為標準品模板，分別加入RRT-PCR反應體系中進行擴增，系統自動分析軟件顯示Ct值與標準品濃度的對數之間存在良好的線性關系(圖1、圖2)。

2.3 特異性試驗

以AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常見其他禽病病毒及NDV Class II核酸(表1)和健康雞組織RNA、水為模板，進行熒光定量PCR，沒有發現有效擴增。NDV Class I光信號明顯。

2.4 靈敏度試驗

從圖1可見，當1 μl標準質粒濃度≥1.0拷貝數時仍可出現典型擴增曲線。從圖2可見，在較廣的范圍內(1 μl 1.0×102～1.0×108拷貝數)，Ct值與質粒拷貝數的對數之間呈現很好的線性關系，決定系數R2=0.99。將其檢測限的Ct值通過標準曲線換算成初始模板拷貝數約為1 μl 1拷貝，相當于1個NDV顆粒。

2.5 重復性試驗

批內重復性試驗:分別取等量的3份不同滴度(1 μl 102拷貝、104拷貝、106拷貝)的重組質粒進行熒光定量PCR檢測，每份樣品做5個重復;批間重復性試驗:取以上3份樣品，在同一反應條件下進行5次獨立的熒光定量PCR檢測。結果顯示，批內變異系數為0.43%～0.99%，批間變異系數為0.95%～1.39%(表2)，表明誤差都非常小，重復性好。

表1 NDV標準參考分離株及其他禽病病毒株Table 1 NDV standard reference isolates and other avian viruses isolates

圖1 熒光定量RT-PCR擴增動力學曲線Fig.1 Dynamic curve of real-time fluorescent quantitative RTPCR

圖2 RRT-PCR標準曲線Fig.2 Standard curve of real-time RT-PCR

2.6 驗證結果

RRT-PCR與病毒分離結果見表1，結果顯示，2種方法檢測33株NDV，陰性和陽性結果完全符合，符合率為100%。

表2 用熒光定量RT-PCR檢測3份不同病毒含量標準品的批內和批間重復檢測結果Table 2 Intra-and inter-assay reproducibility of fluorescent quantitative RT-PCR for 3 standard samples

3 討論

本研究的目的是制定一個快速﹑實時RT-PCR方法檢測和區分禽臨床樣本中所有的新城疫病毒。眾所周知，由于新城疫病毒基因組序列之間的高異質性［6］，設計可以擴增每個新城疫病毒分離株的PCR引物，已被證明存在一些困難［7］。大多數努力集中于F基因［7］。

將熒光定量RT-PCR應用于新城疫病毒的檢測已有報道。Mark等［2］建立了RRT-PCR技術檢測鳥類臨床標本新城疫病毒。檢測采用單管水解探針，引物和探針根據M基因保守區序列設計，可檢測到大約1 000拷貝病毒基因組RNA和10 EID50病毒。Beate等［8］建立了高通量的檢測外來NDV的RRTPCR方法。Mia等［9］建立了基于新城疫病毒L基因基礎上的RRT-PCR技術，對Mark等建立的新城疫病毒M基因RRT-PCR是一個有力的補充。Sheau等［10］報道 NP基因相對比 F基因更保守。劉曉文［11］研究結果表明Class I分離株NP基因之間氨基酸序列的同源性為93.0%～99.5%，Class I毒株與 Class II毒株 NP蛋白質同源性為 88.2%～92.5%。本研究選取Class I NP基因保守區設計引物和探針，首次建立了一種新的基于NP基因的檢測新城疫病毒Class I的RRT-PCR方法，對Mark等建立的新城疫病毒M基因RRT-PCR也是一個重要的補充。這兩個方法結合可以快速檢測所有Class I和Class II新城疫病毒并進行初步分群。隨著NDV分子生物學研究的不斷深入，NDV基因序列及功能得到不斷的揭示，ND分子生物學檢測技術將得到進一步的補充和完善。

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