甘肅高山細毛羊TLR2基因遺傳多態性及其與乳房炎相關性

張 欣， 張小麗， 馬小軍， 李發弟， 張 晨， 陳富強， 宋曉育

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070;2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070;3.甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，甘肅 民勤 733300)

甘肅高山細毛羊(Gansu alpine fine-wool sheep)是中國育成的第一個高山型毛肉兼用細毛羊品種，它是以新疆細毛羊、高加索細毛羊為父本，當地蒙古羊、西藏羊為母本，經過雜交改良、橫交固定、選育提高3個育種階段培育而成的。甘肅高山細毛羊主要分布在祁連山高寒牧區，有優良的高原抗逆性，在高寒草原有著重要的生態學地位和社會經濟意義［1-2］。品種育成后，為提高生產性能及羊毛品質開展了大量的選育工作并取得很大成效，但在選育過程中也出現一些常見的控制難度大的疾病，乳房炎就是其中之一，嚴重阻礙養羊業迅速發展。乳房炎是母羊在哺乳期及羔羊斷乳前后常見的疾病，而且隱性乳房炎發病率高，病程長，給養羊業造成嚴重的經濟損失［3-4］。鏈球菌與葡萄球菌是引起乳房炎的主要病原菌［5-6］，但是由于細菌的耐藥性，僅利用抗生素治療很難達到理想的效果。隨著動物育種向分子水平發展，對乳房炎抗性候選基因的研究成為控制乳房炎的一個新切入點。Toll樣受體(TLR)屬于I型跨膜蛋白受體，該受體在病原體入侵機體的早期即啟動天然免疫［7］，在抗感染中起重要作用。基因多態性影響機體對疾病的遺傳易感性，基因TLR位點多態性與炎性應答損傷和感染性疾病的遺傳易感性相關［8-10］。TLR2基因為TLR大家族中第2個成員，TLR2基因編碼的蛋白質分布很廣泛，在脾臟、外周血白細胞和乳腺組織均高度表達［11-12］，它能夠識別多種病原體相關分子模式，可對G+菌的胞壁成分肽聚糖和脂磷壁酸、G-的類脂A、細菌DNA等進行模式識別，還可識別完整G+菌，從而激活細胞內信號傳導機制。因此，TLR2是研究羊乳房炎抗病性的重要候選基因。

研究結果表明，乳房炎和體細胞評分(SCS)的遺傳力系數大約為 0.30～0.98，并認為能夠根據SCS對抗乳房炎性狀進行間接選擇，因此SCS是目前對乳房炎進行監測最可靠的方法［13］。乳樣中體細胞數(SCC)直接計數所得的數值差距范圍太寬，且為偏態的分布頻率，為避免分析中的不足，呈現較理想的統計學特征，可通過公式SCS=lg2(SCC/ 100 000)+3［14-16］將SCC轉換成SCS。

為探索甘肅高山細毛羊TLR2基因多態性與乳房炎抗性之間的關系，本試驗采用PCR-SSCP技術檢測TLR2基因多態位點，并分析其多態性與體細胞評分(Somatic cellscore，SCS)的相關性，為進一步研究標記輔助選擇育種、培育乳房炎抗性新品系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣 286份甘肅高山細毛羊血液樣品采自甘肅省天祝縣某規模化養殖場。

1.1.2 乳樣 286份乳樣采自甘肅省天祝縣某規模化養殖場，每只羊采集常乳10 ml左右。

1.2 方法

1.2.1 采血 每只羊于頸靜脈采血10 ml，檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，-20℃冷凍保存備用。

1.2.2 乳樣的處理 采用Fossomatic Minor儀器測得體細胞數(SCC)，通過公式SCS=lg2(SCC/ 100 000)+3換算成體細胞評分(SCS)。

1.2.3 基因組DNA提取 采取常規酚氯仿抽提法從全血中提取基因組DNA，經1%瓊脂糖電泳檢測后-20℃冷凍保存。

1.2.4 引物設計與合成 根據GenBank發表的綿羊基因序列(登錄號:NM-001048231)并參考相關文獻，利用PrimerPremier5.0軟件對羊TLR2基因可能存在突變位點的基因片段設計1對引物(表1)。引物由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物名稱、位置及序列Table 1 The name，position and sequence of primers

1.2.5 基因的擴增 采用25 μl反應體系:上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，滅菌雙蒸水8.5 μl，DNA-TAQ預混酶12.5 μl。PCR反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸15 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 PCR產物的SSCP分析 取2 μl PCR產物，8 μl變性劑(98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍、0.5 mol/L混合而成)，經98℃變性10 min，迅速放置于冰上10 min，以保持變性狀態。在14%非變性聚丙烯酰胺凝膠上，4℃、150 V，電泳17 h，銀染法顯色。

1.2.7 克隆測序 PCR產物經SSCP分析后，純合基因型個體的PCR擴增產物進行凝膠純化后送至北京金唯智生物科技有限公司進行雙向測序。雜合基因需進行克隆再進行測序。

1.2.8 數據統計分析 用DNASTAR中的Megalign、Clustal對所測的甘肅高山細毛羊TLR2基因序列進行同源序列比對分析。通過POPGEN32計算TLR2基因的基因型頻率、等位基因頻率以及雜合度、卡方值等。體細胞計數(SCC)高于6.40× 106或低于5 000均為異常，在分析時剔除，采用SPSS19.0統計軟件一般線性模型，對乳房炎性狀受TLR2基因各基因型影響做顯著性檢驗。采用下列公式進行最小二乘分析，分析基因型效應:yjkl=μ+ Gl+Hj+Pk+ejkl其中:yjkl為體細胞評分值;μ為群體均值;Gl為第l種基因型的固定效應;Hj為第j個羊場的固定效應，j=1，2;Pk為第k個胎次的固定效應，k=1，2，3;ejkl為隨機誤差效應。

2 結果

2.1 TLR2基因的PCR擴增

應用特異性引物以提取的總DNA為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出212 bp的特異性目的條帶(圖1)，與預期片段大小一致。

2.2 SSCP分型及測序分析

PCR產物經SSCP電泳，在擴增片段中發現多態性，根據條帶不同分為3種基因型(圖2):AA、AB、BB。將不同基因型的PCR產物測序，以GenBank中羊的TLR2基因序列(登錄號NM-001048231)為參考進行序列比對分析(圖3)，共發現5個突變位點，分別為62 bp處G→A，72 bp處C→T，92 bp處 T→G，120 bp處A→G，179 bp處G→A。突變引起3處氨基酸的改變(圖4)，62 bp處和179 bp處核苷酸的顛換導致精氨酸(Arg)變為賴氨酸(Lys)，92 bp處的核苷酸顛換導致纈氨酸(Val)變為甘氨酸(Gly)。

圖1 TLR2基因目的片段的擴增Fig.1 Amplification of TLR2 gene

圖2 TLR2基因的PCR-SSCP檢測Fig.2 Electrophoresis profile of TLR2 gene by PCR-SSCP

圖3 TLR2基因等位基因核苷酸比對結果Fig.3 Nucleotide sequences alignment of alleles of TLR2

2.3 基因型頻率與等位基因頻率

根據PCR-SSCP結果，通過遺傳學統計方法對286頭甘肅高山細毛羊進行基因型頻率和等位基因頻率的統計分析，結果見表2。

圖4 TLR2基因等位基因氨基酸序列比對結果Fig.4 Amino acid sequences alignment of alleles of TLR2

表2 基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype frequency and allele frequency

2.4 遺傳多態性分析

群體的多態信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和Hardy-Weinberg平衡分析結果見表3，由表3可以看出多態信息含量(PIC)為0.25～0.50，處于中度多態。經χ2適合性檢驗，χ2值為0.085(P＞0.05)，該突變達到Hardy-Weinberg平衡狀態。

表3 TLR2基因的遺傳多態性指標Table 3 PIC，Ho，He，Neand χ2 of TLR2 gene

2.5 基因型與SCS相關性分析

應用SPSS19.0軟件中的一般線性模型分析基因型對乳房炎性狀的效應，結果(表4)表明，AB和BB基因型個體的SCS顯著高于AA型個體，表明A等位基因可能是甘肅高山細毛羊乳房炎抗性的優勢基因。

表4 TLR2基因不同基因型在群體中SCS的最小二乘均值及標準誤Table 4 Group least squares mean value and standard error of TLR2 gene of different genotypes

3 討論

3.1 TLR2基因遺傳多態性分析

本試驗對甘肅高山細毛羊TLR2基因的多態性進行了分析，χ2檢驗結果顯示，試驗群體遺傳突變處于Hardy-Weinberg平衡狀態，說明所選甘肅高山細毛羊群體TLR2基因處于遺傳平衡狀態。對于一個群體來說，He與PIC數值越大，反映此群體基因的一致性越差、變異性越大，選擇潛力越大;反之，數值越小，反映群體變異越小，選擇潛力也就越小［17］。本試驗中PIC達到0.327(0.25＜P＜0.50)，為中度多態，遺傳變異大。因此，在甘肅高山細毛羊選育過程中應該加強人工選擇的強度。就基因頻率而言，A、B等位基因在試驗羊群中均有分布，等位基因頻率分別為0.29和0.71，B等位基因在群體中占優勢，可能是因為核苷酸的顛換導致蛋白質氨基酸的改變，從而改變了基因的部分功能;另外，甘肅高山細毛羊是毛肉兼用細毛羊品種，在對其選育過程中可能過于注重產毛量與產肉率的提高，忽視了抗病性的選育，從而增加了B等位基因頻率，相對降低了A等位基因頻率。

3.2 TLR2基因多態性與甘肅細毛羊乳房炎的關系

相關研究結果表明，TLR2基因多態性與某些疾病的發生有相關性，TLR2基因參與豬鏈球菌誘導的自噬作用，其多態性與蛋鴨免疫細胞因子TL-2顯著相關，Asp299Gly(表示299位點突變導致氨基酸突變，使天冬氨酸突變為甘氨酸)與病情的嚴重程度有較大相關性［18］，Arg667Trp(表示667位點突變導致氨基酸突變，使精氨酸突變為色氨酸)多態性與結核的易感性相關［19］。TLR2基因能夠識別完整的G+菌，比如引起羊乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌和鏈球菌［20］。本試驗發現甘肅高山細毛羊TLR2基因存在多態位點，其中179 bp處發生突變，存在多態性，這與馬騰壑等［21］的研究結果相近，表明此處突變可能對乳房炎抗性有極大影響。SCS與乳房炎的遺傳力約為0.30～0.98，因此，本試驗將SCC轉換為SCS，并將其作為乳房炎的表征數據進行相關性分析，結果顯示不同基因型對SCS影響有顯著差異，AA基因型個體SCS顯著低于AB型和BB型個體(P＜0.05)，說明AA基因型與乳房炎抗病性有關，所以A等位基因可能為抗乳房炎的優勢基因。

甘肅高山細毛羊TLR2基因有遺傳多態性，屬中度多態。TLR2基因多態性對乳房炎有較大調控作用，TLR2基因可作為甘肅細毛羊乳房炎抗性的候選基因，培育甘肅高山細毛羊乳房炎抗性品種。

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