水牛透明帶3基因啟動子克隆及轉錄活性檢測

龐春英， 陸杏蓉， 朱 鵬， 鄧廷賢， 段安琴， 陳明棠， 楊炳壯， 梁賢威

(中國農業科學院廣西水牛研究所廣西水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西 南寧 530001)

水牛具有適應性強、耐高溫高濕、耐粗飼、抗病力強、使用年限長、靜默發情、繁殖力低和產奶量低等生物學特點，非常適合于中國南方農村飼養［1-2］。據聯合國糧食與農業組織(FAO)2013年統計數據，2011年底中國水牛存欄量達2.338 2×107頭，僅次于印度的1.129 16×108頭和巴基斯坦的3.172 6×107頭，位居世界第3。水牛在中國畜牧業產業中占有重要地位，是重要的肉、乳和役兼用畜種資源，水牛奶更有“奶中之王”之稱。但是，當前繁殖力低是制約水牛養殖業發展的瓶頸。水牛性成熟晚，屬季節性發情動物，產后卵巢長時間不活動，發情癥狀不明顯，懷孕率低，各地調查的繁殖率為30%～60%;通過超數排卵結合活體采卵技術(O-vum pick up，OPU)每個水牛卵巢可以獲得2.25枚卵母細胞［3-4］，而黃牛平均卵母細胞數則高達30.84±0.88枚［5］。因此，深入闡明水牛繁殖調控的機理，了解其卵泡發生模式，尤其是關鍵基因的表達和作用方式，對于提高水牛的繁殖力具有重要意義，但是當前關于水牛繁殖分子機制的研究較少［6-10］。

透明帶蛋白對于脊椎動物的精卵識別、多精受精的防控以及胚胎的保護起著關鍵性的調節作用。透明帶蛋白家族，由透明帶蛋白1(Zona pellucida 1，ZP1)、透明帶蛋白2(Zona pellucida 2，ZP2)、透明帶蛋白3(Zona pellucida 3，ZP3)和透明帶蛋白4(Zona pellucida 4，ZP4)組成。小鼠的透明帶由ZP1～ZP3組成，其中ZP3蛋白是小鼠主要的精子受體，能夠誘發小鼠精子的頂體反應［11］。人的透明帶由ZP1～ZP4組成，其中ZP1、ZP3和ZP4與精子結合并誘發頂體反應［12］。豬和牛的透明帶由ZP2、ZP3和ZP4組成，其中ZP3與ZP4形成異源二聚體，然后與精子結合［13］。ZP3基因特異表達于動物的初級卵母細胞中［14］，已被成熟地應用于基因的時空特異性敲除［15］。但當前關于水牛ZP3基因的表達調控機制研究較少，鑒于此，本研究旨在克隆水牛ZP3基因5′側翼序列，對其序列特征進行生物信息學分析，并構建pZP3-EGFP-1真核表達載體，轉染HEK-293T細胞和CHO細胞，分析ZP3啟動子的組織表達特異性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用水牛選自中國農業科學院廣西水牛研究所水牛養殖基地。

1.2 主要試劑

水牛血液基因組提取試劑盒TIANamp Marine Animals DNA Kit、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒和DH5a感受態細胞均購自天根生化科技有限公司，去內毒質粒提取試劑盒購自OMEGA公司，LA Taq酶、BamH I和EcoR I限制性內切酶、pMDl8-T Vector均購自大連TaKaRa公司，T4連接酶購自Fermentas公司，DMEM高糖基礎液體培養基(GIBCO)、胎牛血清(FBS，Hyclone)、胰酶和脂質體轉染試劑盒(Life 3000，Invitrogen)等購自Life公司。倒置熒光顯微鏡(Nikon)、0.22 μm過濾器(Millipore)、其他試劑無特殊說明的均購自Sigma公司。試驗所用載體、細胞均為中國農業科學院廣西水牛研究所保存。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計 以奶牛ZP3基因序列(DQ489319.1)為參考，進行同源比對，根據In-Fusion引物設計特點，應用Oligo 6.0軟件針對ZP3的同源保守區域設計了1對引物，擴增ZP3基因5′端3 081 bp。引物 ZP3-F序列為5′-CTCAAGCTTCGAATTCTCTAGACAACCCCACCCTACTCCCAG-3′，ZP3-R序列為5′-CATGGTGGCGACCGGTCGGTGCCGAAAAGGTCTTTG-3′，下劃線處為In-Fusion引物同源區域，退火溫度為55℃。

1.3.2 水牛血液基因組DNA的提取及PCR擴增按照血液基因組提取試劑盒TIANamp Marine Animals DNA Kit操作說明書提取水牛基因組DNA。PCR反應體系20 μl:模板1 μl，上、下游引物(各20 μmol/L)各1 μl，PrimeSTAR Max Premix(2×)10 μl，ddH2O補至20 μl。PCR反應條件為:98℃預變性3 min;98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，35個循環;72℃延伸7 min，4℃終止反應。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收并進行TA克隆。

1.3.3 生物信息學分析 應用NCBI數據BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對沼澤型水牛ZP3測序結果進行同源序列比對，用MEGA5.0軟件進行分子進化樹構建，用Promoter (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml? topic=fprom＆group=programs＆subgroup=promoter)預測啟動子，用Gpminer(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)預測啟動子和轉錄因子，用Jaspar(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl? rm=browse＆db=core＆tax_group=vertebrates)預測轉錄因子，用Methprimer(http://www.urogene.org/ cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預測CpG島。

1.3.4 載體構建 應用Bgl II和Age I雙酶切骨架載體pEGFP-1，酶切體系及方法參照試劑說明書。酶切3 h后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和膠回收，并于4℃保存用于后續In-Fusion連接。In-Fusion連接體系:5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μl，PCR膠回收產物6 μl，線性化骨架載體2 μl。反應條件為:50℃15 min，之后4℃保存。轉化、質粒提取、去內毒質粒提取等嚴格按照試劑盒的操作說明書進行。重組質粒送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3.5 細胞培養及轉染 HEK-293T和CHO細胞系用含有10%進口胎牛血清(FBS)的DMEM培養基，于37℃、5%CO2濃度下培養，隔天傳代。轉染按照Life 3000轉染試劑盒的操作說明書進行。48 h后在倒置熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白(EGFP)的表達情況。

2 結果與分析

2.1 水牛ZP3基因的克隆與鑒定

以水牛血液基因組為模板，應用設計的特異性引物擴增ZP3基因，經PCR成功擴增獲得3 081 bp的特異性條帶(圖1)，與預期結果一致。

圖1 水牛ZP3基因的擴增與亞克隆Fig.1 Amplification and subcloning of buffalo ZP3 gene

2.2 水牛ZP3基因序列分析

對獲得的陽性重組質粒進行測序分析，獲得水牛ZP3基因序列。應用NCBI的BLAST軟件進行相似性比對分析，結果顯示，廣西本地水牛ZP3核酸序列與河流型水牛、黃牛、綿羊和山羊的相似性分別為99%、96%、92%和92%，表明ZP3基因在不同哺乳動物中具有較高的序列保守性。

2.3 水牛ZP3基因系統進化樹

選擇所克隆得到的廣西本地水牛ZP3基因序列與黃牛、小鼠和人相關序列進行多重序列比較，結果表明廣西本地水牛ZP3基因序列與黃牛具有較高的相似性，與小鼠和人的序列差別較大。進一步應用MEGA5.0軟件，用NJ法構建系統進化樹(圖2)。由圖2可知，水牛與黃牛的相應序列聚為一支，與綿羊的遺傳距離相對較近，進化樹的形態與分類學具有較高的一致性，進一步說明克隆的序列為水牛ZP3基因。

2.4 水牛ZP3基因啟動子和轉錄因子的生物信息分析

選取廣西本地水牛ZP3基因5′側翼2 000 bp序列，進行啟動子及轉錄因子反式作用元件等分析。Gpminer在線網站預測結果顯示，在-147 bp至-196 bp區域存在啟動子特征序列(TATA box)，序列為 TCATCAGGGGTATAAGACGGTGGGTGGTGCCTGCCCAGGAGTCACAGTGG。經Jaspar和Gpminer軟件預測發現本地水牛ZP3基因5′側翼序列2 000 bp內存在2個潛在核心啟動子區，其中一處為-50 bp至-409 bp區域，此區域存在 TBP(-187 bp……-173 bp)、SP1(-60 bp……-50 bp)、CEBPA (-409 bp……-399 bp)和USF1，2(-126 bp……-116 bp)等結合位點，分別結合 TATA box、GC box、CAAT box和 E box;另一處為 -1 031 bp至-1 248 bp處，此區域存在TBP(-1 069 bp……-1 031 bp)、SP1(-1 248 bp…… -1 226 bp)、CEBPA(-1 122 bp…… -1 112 bp)和 USF1，2 (-1 105 bp……-1 095 bp)等轉錄因子結合位點。此外在廣西本地水牛ZP3基因5′側翼序列2 000 bp內，也存在Foxo3、Nobox、Stat3、Stat5a、Stat5b、Stat6、YY1和Gata家族等反式作用元件結合位點，其中Stat家族基因在ZP3基因啟動子區存在多個結合位點，且ZP3同一位點處存在多個Stat家族基因結合的情況(圖3、圖4、圖5)。通過Methprimer預測發現在ZP3基因翻譯起始位點上游不存在CpG島。

圖2 水牛與其他物種ZP3基因核苷酸序列的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ZP3 gene among buffalo and other species based on nucleotide sequence

圖3 水牛ZP3基因啟動子的預測Fig.3 Prediction of the promoter of buffalo ZP3 gene

2.5 pZP3-EGFP-1真核表達載體構建及轉錄活性檢驗

應用In-Fusion技術構建pZP3-EGFP-1真核表達載體，電泳及測序結果表明所構建載體正確(圖1)。應用脂質體Life 3000，將陽性對照質粒pEGFPN1轉染HEK-293T和CHO細胞系，陰性對照質粒pEGFP-1轉染HEK-293T和CHO細胞系，所構建的pZP3-EGFP-1質粒轉染HEK-293T和CHO細胞系，48 h后進行熒光觀察。結果表明:陽性對照載體pEGFPN1在HEK-293T和CHO細胞系中有EGFP蛋白表達，且在HEK-293T中熒光信號顯著強于CHO細胞系;陰性對照載體pEGFP-1在HEK-293T和CHO細胞系中均無EGFP蛋白表達;試驗載體pZP3-EGFP-1在HEK-293T細胞系中無EGFP蛋白表達，在CHO細胞系中有EGFP蛋白表 達(圖6)。

圖4 水牛ZP3基因啟動子區轉錄因子的預測Fig.4 The prediction of transcription factor of buffalo ZP3 promoter

圖6 水牛ZP3基因啟動子的轉錄活性Fig.6 The transcriptional activity of promoter of buffalo ZP3 gene

3 討論

小鼠透明帶由ZP1、ZP2和ZP3 3種糖蛋白組成，三者的含量比值為1∶4∶4［16］。其中ZP3基因特異表達于初級卵泡階段及其之后的卵母細胞中［17］。ZP3的缺失，一方面致使透明帶不能形成，另一方面致使胚胎發育不能躍過2細胞期［18］。人的ZP3基因位于7號染色體上，含有7個可變剪切體，其中4個可以編碼蛋白質，分別編碼373 aa、424 aa、248 aa和258 aa。編碼區最長的可變剪切體含有8個外顯子和7個內含子。小鼠的ZP3基因位于5號染色體上，含有2個可變剪切體，僅有1個可以編碼蛋白質，含有5個外顯子和4個內含子。黃牛的ZP3基因位于25號染色體上，編碼421 aa。對透明帶基因表達調控研究發現，位于透明帶蛋白質翻譯起始位點上游 200bp處存在 E-box (CANNTG)，能夠與反式作用因子Figla和USF1等結合，從而促進透明帶蛋白質基因的表達［19］。Shi等［20］研究發現，鯽魚的ZP1、ZP2和ZP3基因聚集在一起，其跨度為10 855 bp，其中ZP2和ZP3間的1 097 bp具有雙向啟動子的特性，能夠同時調節ZP2和ZP3基因的表達。本研究成功克隆獲得沼澤型水牛ZP3 5′側翼序列及部分外顯子序列，共3 081 bp，同源性分析結果表明其與河流型水牛和黃牛的序列相似性較高。

本研究通過信息學分析發現，在水牛ZP3啟動子區內存在2個潛在核心啟動子區，其中一處為-50 bp至-409 bp區域，此區域存在 TBP、SP1、CEBPA和USF1，2等結合位點，與文獻［21］報道的一致;另一處為-1 031 bp至-1 248 bp處，此區域存在TBP、SP1、CEBPA和USF1，2等轉錄因子結合位點。此外還存在 GATAs、Foxo1、Foxo3、Stats和YY1等反式作用元件結合位點，且存在Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b以及Stat6同時結合的位點，提示Stats可能通過形成二聚體的形式調控ZP3的表達。通過構建pZP3-EGFP-1表達載體轉染HEK-293T和CHO細胞，發現ZP3 5′側翼序列能夠啟動綠色熒光蛋白表達于 CHO細胞中，但不能啟動其表達于HEK-293T細胞中，表明所克隆獲得的沼澤型水牛ZP3 5′側翼序列具有組織表達特異性。總之，本研究成功克隆了廣西本地水牛ZP3 5′側翼區域，并驗證了其轉錄活性，但對其轉錄調節機制還需進行進一步研究。

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