蛇床子素對稻瘟病菌侵染的影響

齊中強， 薛延豐， 張 猛， 李麗娜， 石志琦

(1.江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所，江蘇 南京 210014;2.江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇 南京210014)

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生產上的重要病害之一，在全世界稻區均有發生。且稻瘟病菌在水稻的整個生育期均能侵染，嚴重威脅世界糧食安全［1-2］。防治稻瘟病最有效的措施是選育和利用抗病品種，但由于稻瘟病菌的高度易變性，抗病品種種植3～5年后，就降低甚至喪失對稻瘟病的抗性［3-4］，因此，化學防治仍然是防治稻瘟病的關鍵措施之一。目前中國的防治藥劑主要以春雷霉素、稻瘟靈以及三環唑為主，由于藥劑使用較為單一，稻瘟病菌容易對上述藥劑產生抗藥性，并且存在農藥殘留等安全隱患。因此研究和開發安全、高效、經濟的新藥劑尤為重要。

天然化合物蛇床子素是傘形科植物蛇床子［Cnidium monnieri(L.)Cuss.］的主要成分，屬于香豆素類化合物，它對植物病原菌具有廣泛的抑制作用［5］，但其對稻瘟病是否具有防效以及對稻瘟病菌的抑制作用如何等還未有報道。本研究主要從蛇床子素對稻瘟病菌致病力，附著胞形成和菌絲生長的抑制等方面進行研究，為開發新型、安全、優良防效的植物源農藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Guy11由南京農業大學植物保護學院真菌與卵菌實驗室提供。

蛇床子素(純度99.5%，購自中國藥品生物制品檢定所)用無水乙醇配制成濃度為2×104μg/ml后置4℃冰箱保存。使用前用ddH2O稀釋成不同濃度。

水稻為感病品種CO39，由南京農業大學植物保護學院真菌與卵菌實驗室提供。

培養基為CM(完全培養基)，SDC(產孢培養基)［6］。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲干質量測定 從CM培養基上生長5～7 d的菌落邊緣使用直徑1 cm的打孔器切取菌絲塊，每塊菌絲塊平分為4小塊置于含有不同濃度蛇床子素的每瓶60 ml液體CM培養基中，每瓶12小塊。28℃，150 r/min，黑暗培養48 h。培養結束后，過濾并用吸水紙壓干，置于2 ml EP管中，冷凍抽干，稱質量。每次試驗設置3個重復。

1.2.2 菌絲直徑測定 從CM培養基上生長5～7 d的菌落邊緣上切取3 mm×3 mm的菌絲塊，接種于直徑60 mm的含有不同濃度蛇床子素的CM平板中央，28℃黑暗培養7 d后測量菌落直徑并拍照。每次試驗設3個重復，結果取平均值。

1.2.3 分生孢子形成測定 將野生型Guy11接種在SDC培養基上，28℃黑暗培養7 d左右，待菌絲體長滿平板后，用手術刀將表面氣生菌絲刮掉，于黑光燈下照射3 d，誘導分生孢子產生。收集孢子時，向培養基內加入3 ml無菌水，輕輕用1.5 ml EP管底部將表面氣生菌絲和孢子刷下，然后經過四層擦鏡紙過濾收集孢子。

1.2.4 附著胞形成測定 將蓋玻片(Fisherbrand，12-540-A 18×18-2)放置在載玻片上(下面滴加無菌水)，取40 μl濃度為每1 ml 5×104個的分生孢子液(含有不同濃度蛇床子素)，滴加于蓋玻片中央，隨后將載玻片放入培養皿中28℃黑暗保濕培養4 h、8 h和24 h后分別制片觀測附著胞形成率，并拍照。每次試驗設置3個重復。

1.2.5 水稻點滴致病性測定 將刷下的孢子調至濃度為1 ml 5×104個，剪取生長14 d的水稻葉片鋪于含有保濕濾紙的培養皿中，每張葉片上點滴孢子液3個，以點滴清水為對照，置于28℃黑暗培養24 h，期間需要保持高溫高濕狀態，接種5～7 d后，觀察結果并拍照。每次試驗設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 蛇床子素對稻瘟病菌生長的影響

為了研究蛇床子素對稻瘟病菌Guy11的抑制作用，試驗選取了含有不同濃度的蛇床子素的CM培養基，對Guy11的生長速率及干質量進行測定。圖1A和圖1B表明，蛇床子素濃度為32 μg/ml時，Guy11生長受到明顯抑制，當蛇床子素濃度增加到160 μg/ml時，抑制率達到約65%。同時，檢測了蛇床子素各濃度梯度下Guy11的干質量變化，結果如圖1C所示，Guy11在液體培養條件下對蛇床子素較為敏感，蛇床子素濃度為16 μg/ml時，生長受到抑制，隨著蛇床子素濃度的提高，Guy11干質量逐漸下降，蛇床子素濃度為160 μg/ml時，Guy 11基本不生長。上述結果表明，蛇床子素對稻瘟病菌生長具有明顯的抑制作用，且液體培養條件下，抑制作用更為顯著。

2.2 蛇床子素對稻瘟病菌菌絲的影響

掃描電鏡觀察結果表明正常的稻瘟病菌菌絲飽滿，表面平滑，經60 μg/ml蛇床子素處理后菌絲表面出現干癟及皺縮，部分菌絲甚至出現斷裂等現象(圖2)。

2.3 蛇床子素對稻瘟病發生的影響

圖3表明，添加不同濃度蛇床子素與稻瘟病菌Guy11分生孢子懸浮液混合接種水稻時，20 μg/ml蛇床子素即可降低稻瘟病菌對水稻的致病力，當蛇床子素濃度增加到40 μg/ml，可以完全抑制稻瘟病斑的產生。同時，如圖4所示，先滴加不含蛇床子素的孢子懸浮液8 h和24 h后，滴加50 μg/ml蛇床子素，結果發現蛇床子素均對稻瘟病的發生產生抑制作用。

圖1 蛇床子素對稻瘟病菌生長的影響Fig.1 The growth of Guy11 of Magnaporthe oryza exposed to different concentrations of osthol

圖2 蛇床子素對稻瘟病菌菌絲形態的影響Fig.2 Hyphae morphogenesis of Guy11 exposed to osthol

2.4 蛇床子素對稻瘟病菌附著胞形成的影響

為了探究蛇床子素對稻瘟病菌侵染抑制作用的原因，分析了蛇床子素是否影響稻瘟病菌附著胞的形成。由圖5可知，在蛇床子素濃度為20 μg/ml濃度時，培養4 h和8 h稻瘟病菌孢子均不能產生附著胞，只能萌發產生芽管;表1顯示培養24 h后能夠觀察到附著胞，但形成率顯著下降僅為50%左右，且形成的附著胞較對照變小，芽管變短，對照附著胞形成率接近100%。隨著蛇床子素濃度的提高(40 μg/ml、60 μg/ml)，稻瘟病菌孢子的萌發被完全抑制。上述結果表明蛇床子素能夠抑制稻瘟病菌孢子萌發及附著胞的形成。

3 討論

蛇床子素長期以來被應用于醫藥上，近幾年來，其在抑制植物病原真菌方面的研究正在逐步展開。嚴清平等［7］發現60 μg/ml蛇床子素在處理草莓白粉菌24 h后完全抑制其分生孢子萌發，80～125 μg/ml蛇床子素對該病原菌引起的病害防效達68.7% ～79.5%;王春梅等［8］發現 25 μg/ml、20 μg/ml、16.7 μg/ml蛇床子素對黃瓜白粉病在第3次施藥后7 d防效達97.73%以上。夏禮如等［9］發現1%蛇床子素水乳劑對黃瓜霜霉病具有良好防效，但持效期較對照差。沈國濤等［10］報道蛇床子素對小麥赤霉病菌可能的作用機制是抑制小麥赤霉病菌對葡萄糖、鈣的吸收及ATP酶的活性。

分生孢子在稻瘟病菌的致病過程中具有重要作用［11］。本研究發現蛇床子素對稻瘟病菌生長及孢子萌發具有抑制作用，尤其對孢子萌發的抑制更為顯著，40 μg/ml濃度的蛇床子素處理稻瘟病菌分生孢子即可抑制其萌發且完全抑制稻瘟病斑的產生。本研究結果表明蛇床子素對稻瘟病發生的抑制主要作用于稻瘟病菌的孢子萌發及附著胞形成過程，而且較低濃度下即可達到較好效果。此外，本研究還發現在接種稻瘟病菌孢子8 h和24 h后接種50 μg/ml蛇床子素仍然對稻瘟病的發生具有一定抑制作用。文獻報道稻瘟病菌接種8 h附著胞基本形成，24 h已經成熟，并且開始侵入水稻，因此蛇床子素可能對稻瘟病菌的侵入及擴展也具有影響［12］。

圖3 蛇床子素對稻瘟病菌Guy11侵染的影響Fig.3 Inhibition of osthol against Guy11

圖4 蛇床子素(50 μg/ml)對稻瘟病的治療作用Fig.4 Inhibition of osthol against Guy 11 after 8 h and 24 h

圖5 蛇床子素對稻瘟病菌孢子萌發及附著胞形成的影響Fig.5 Effects of osthol on conidium germination and appressorium formation

對稻瘟病菌生長抑制試驗可知，32 μg/ml濃度蛇床子素處理下，菌絲生長開始受到影響;160 μg/ml濃度蛇床子素處理下，生長基本被抑制，且液體培養條件下，抑制作用更為明顯。通過掃描電鏡觀察發現，經60 μg/ml蛇床子素處理的菌絲呈現畸形，菌絲表面出現干癟及皺縮，部分菌絲出現斷裂等現象。由此推測蛇床子素破壞了稻瘟病菌菌絲細胞壁的完整性。真菌細胞壁完整性對維持其菌絲形態和對外界環境的適應發揮著關鍵作用［13］。石志琦等［14］以100 μg/ml蛇床子素處理液體培養小麥赤霉病菌，同樣發現菌絲大量斷裂。因此推測菌絲斷裂現象發生的原因是菌絲中幾丁質水解酶經蛇床子素處理后，活性升高，使得合成細胞壁的幾丁質前體水解，從而造成細胞壁出現斷裂，嚴重影響細胞壁完整性。除此之外，稻瘟病菌在侵染后期，侵染菌絲在水稻細胞中大量擴展，但一定濃度的蛇床子素對菌絲生長具有抑制作用，因此蛇床子素能夠抑制侵染菌絲的擴展，這也解釋了蛇床子素為什么具有一定的治療作用。

表1 蛇床子素對稻瘟病菌附著胞形成的抑制作用Table 1 Inhibition of osthol against appressorium formation

綜上所述，蛇床子素對稻瘟病菌的抑制作用主要通過破壞菌絲體細胞完整性，影響其對營養成分的吸收及耐脅迫能力;其次，通過抑制分生孢子萌發及附著胞形成影響稻瘟病菌對水稻的致病力。蛇床子素抑制分生孢子萌發及附著胞形成的機制，蛇床子素的可能靶標以及蛇床子素是否誘發水稻的免疫反應等問題還有待進一步研究。

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