卓俊睿，陳永正

(遵義醫學院藥學院，貴州 遵義 563000)

金屬和有機小分子催化的硫醚的不對稱氧化反應得到了長足的發展，而生物催化硫醚的不對稱氧化由于環境友好、反應條件溫和、反應體系較為簡單等優點，近年來引起了研究人員的廣泛關注［1］。生物催化劑的來源主要有自然來源的微生物的篩選、純酶和基因工程菌(Scheme 1)。

Scheme 1

本文綜述了生物催化硫醚底物的不對稱氧化反應的研究進展，重點介紹了微生物菌株整細胞、純酶和基因工程菌等催化劑在硫醚底物的不對稱氧化反應中的應用。

1 微生物催化劑

自然界存在豐富的微生物資源，篩選獲得高活性的氧化酶產生菌株一直是研究者發現和獲取新酶的重要途徑，人們也從未停止去發現和挖掘源于自然的新型生物催化劑(表1)。早在上世紀90 年代，Holland 課題組［2-5］就發現使用真菌Helminthosporiumspecies NRRL4671和Mortierella isabellina的整細胞為催化劑開展了一系列工作，實現了通過催化系列硫醚底物合成具有較高對映選擇性的手性亞砜。他們［6］同時也發現真菌Beau-veria bassianaATCC 7159能選擇性的氧化L-型或者D-型的蛋氨酸成(SSSC或SSRC)的亞砜。后來他們［7］又發現了Rhodococus erythropolisIGTS8 用于芳香硫醚的不對稱氧化反應。French和Gordon等［8］預測了Rhodococus erythropolisIGTS8 催化硫醚底物結構與活性位點關系模型。

Kelly 等［9］也發現Acinetobactersp.NCIMB 9871，Pseudomonassp.9872，Xanthobacter autotrophicusDSM 431和Black yeast NV-2等催化劑也能實現芳香硫醚的不對稱氧化反應。后來，Collado課題組［10］發現了三株真菌，其中Botrytis cinerea顯現出了S選擇性，而Eutypa lata和Trichoderma Viride菌株則具有相反的選擇性，獲得R構型的手性亞砜。

近年來，許建和課題組［11］從上海、山東和江蘇等地煤的氣化站采集的土壤中分離獲得了對映選擇性互補的微生物菌種庫，其中單加氧酶產生菌株Rhodococcussp.Strain ECU0066能有效的催化系列硫醚底物的不對稱氧化反應，獲得14% ～86%的產率和38%～99%ee值的手性亞砜類化合物，他們并研究了該反應的機理，該反應是通過氧化-氧化拆分二步來實現，底物濃度能達到10 mmol·L-1。為了進一步提高反應的催化效率，他們［12］建立了水-異辛烷雙相反應體系，在2.4 L的生物反應器中可以實現底物濃度為150 mmol·L-1的苯甲硫醚的生物氧化反應，產率為49%，對映選擇性達到99%。采用水-正辛烷兩相反應體系，以Rhodococcussp.CCZU10-1 為催化劑，也可以獲得S構型的苯甲亞砜，底物濃度可達到55.3 mmol·L-1，產物的ee值達到 99%［13］。由于他們發現單加氧酶產生菌株Rhodococcussp.Strain ECU0066催化苯甲硫醚的反應是通過氧化-氧化拆分來進行的，他們［14］探索了采用消旋化的亞砜為底物，研究其不對稱氧化拆分反應，在較短的反應時間內仍然可以催化消旋化亞砜底物的不對稱氧化拆分，獲得較高的對映選擇性。

表1 主要微生物來源催化劑Table 1 The main sources of microorganisms biocatalysts

與此同時，Elkin課題組［15］發現了一些能完全轉化硫醚為手性亞砜的生物酶催化劑，Gordonia terraeIEGM136和RhodococcusIEGM66能有效的催化系列芳香硫醚為相應的高光學活性的亞砜，其ee值分別達到89%和95%。本課題組［16］也從河床的淤泥中發現一株假單胞菌Pseudomonas monteiliiCCTCC M2013683，能有效催化苯甲硫醚的不對稱氧化反應，底物濃度在30 mmol·L-1的情況下，仍然可以獲得99%的產率和99%的ee值，但是當芳香環上具有不同的取代基時，反應的活性和對映選擇性均受較大影響。

對于芳香硫醚底物的直接氧化，可以直接將一些手性亞砜類藥物的前體硫醚作為底物，通過生物催化氧化，實現一步氧化直接合成目標亞砜藥物(Chart 1)。比如 Nagasawa等［17］通過篩選獲得菌株Cunninghamella echinulataMK40，其整細胞可以直接催化雷貝拉唑前體硫醚的氧化，可獲得ee值達到99%的S構型的雷貝拉唑。Kyslík等［18］篩選獲得菌株Lysinibacillussp.B71，幾乎可以得到對映純的埃索美拉唑。

Chart 1

2 純酶催化劑

生物催化硫醚不對稱氧化反應所使用的純酶催化劑主要有超氧化物酶、單加氧酶及其他酶等。1995年，Holland小組從AcinetobacterNCIB9871菌株中發現了依賴于NADPH的環己酮單加氧酶催化系列芳香硫醚的不對稱氧化反應，硫醚的底物結構對催化活性和對映選擇性均具有較大影響，比如烷基側鏈連接Cl，CN，CH=CH2和OH等基團時，催化效率很低。他們后來構建了葡萄糖脫氫酶和環己酮單加氧酶的循環體系，促進輔酶循環再生，轉化率得到提升，同時副產物砜減少［19］。Baeyer-Villiger單加氧酶可以催化硫醚、二噻烷和消旋化亞砜的對映選擇性氧化，苯乙酮單加氧酶和4-羥基苯乙酮單加氧酶可以催化芳香硫醚的氧化，后來4-羥基苯乙酮單加氧酶的變種顯現出了更廣的底物范圍［20］。Gotor等［21］采用苯乙酮單加氧酶和4-羥基苯乙酮單加氧酶研究了雜環類硫醚的不對稱氧化反應，大多數底物均獲得了25% ～99%的ee值。

超氧化物酶是一類重要氧化還原酶，在生物氧化反應中有較多的應用，比如可以催化硫醚、烯烴或者 C -H 鍵的氧化反應［22］。Hager等［23］首次將氯過氧化物酶從真菌Caldariomycesfumago中分離出來，Allenmark等人使用氯超氧化物酶催化系列芳香環狀硫醚的氧化，獲得9% ～99%的產率和3% ～99%ee值。Lutz等［24］通過采用電化學原位產生過氧化氫代替傳統的直接加入氧化劑的方式，采用氯過氧化物酶催化合成R構型的手性亞砜。

Scheme 2

Jiang等［25］使用氯過氧化物酶催化合成了手性藥物莫達非尼(Scheme 2)，加入［ENIM］［Br］離子液體和季銨鹽至反應體系中可提高產率。Wever等［26］在用來源于Ascophyllum nodosum的釩溴超氧化物酶催化芳香硫醚的氧化時發現芳香環上連有吸電子基團的硫醚作為反應底物時，反應活性急劇下降，而當吸電子基團為NO2或CN時，反應甚至不能發生。此外，該酶還可以催化非芳香的環狀硫醚的不對稱氧化拆分，獲得相應的亞砜。

3 基因工程菌催化劑

現代分子生物學技術的發展為高效基因工程菌催化劑的構建提供了可能，同時還可以通過改造酶和進化酶獲得高活性和選擇性的催化劑。許建和課題組［27］通過P450單加氧酶和葡萄糖脫氫酶的共表達，構建的重組工程菌能有效實現對氯苯甲硫醚的氧化，底物濃度可達2 mmol·L-1～5 mmol·L-1。陳振明等［28］將來源于Acinetobater calcoaceticus的環己酮單加氧酶基因與來源于Candida boidinii的醇脫氫酶基因在大腸桿菌中共表達，在底物濃度達20 mmol·L-1的情況下，產物ee值達99%。Bornscheuer等［29］從PseudomonasputidaJD1中發現4-羥基苯乙酮單加氧酶也能有效催化苯甲硫醚的不對稱氧化。源于Stenotrophomonas maltophilia的黃素單加氧酶可以采用NADPH或者NADH為輔酶的單加氧酶，Grogan課題組［30］突變單加氧酶 sMFO時，將52-位的苯丙胺酸替換為纈氨酸時，得到Phe52Val突變體，其催化系列硫醚合成7%～41%ee的S構型的亞砜產物，而采用未突變的單加氧酶sMFO催化反應時，獲得19% ～80%ee且構型為R的亞砜。

Fishman等［31］以甲苯單加氧酶為研究目標，通過突變V106的纈氨酸和I100的亮氨酸，其反應速率和對映選擇性均得到了較大提高。后來他們又通過飽和突變的方法對硝基苯雙加氧酶207位殘基進行突變，獲得突變體V207I和V207A，在催化苯甲硫醚的反應時顯示出了不同的對映選擇性，并認為硫醚底物與對硝基苯雙加氧酶之間的活性位點可能與疏水相互作用和空間位阻有關，從而相應的影響活性與對映選擇性。Li課題組［32］采用P450pyrI83H與葡萄糖脫氫酶進行共表達，在磷酸緩沖溶液和離子液體［P6，6，614］［Ntf2］的雙相反應體系中，離子液體對底物和酶顯示出了較好的溶解性和生物相容性，在催化反應的過程中，底物濃度和對映選擇性均得到了不同程度提高。

4 結論與展望

生物催化硫醚的不對稱氧化反應近年來取得了較大的突破和進展，但是同生物催化還原和水解等反應相比較，硫醚底物濃度低仍然是研究過程中最關鍵的瓶頸。與此同時，如何抑制過度氧化產物砜的形成也是未來研究的重點，其核心是要發現和改造高活性和高對映選擇性的催化劑。野生菌株的篩選是獲得具有高底物濃度和高選擇性的生物催化劑的常規方法之一。隨著現代分子生物學技術的發展，如何通過基因組數據庫挖掘高活性和高選擇性的硫醚氧化酶基因將成為研究的重點，并結合定向進化和半理性設計等人工改造的方式，去尋找和發現高活性的硫醚氧化酶。此外，構建輔酶循環再生系統、酶的固定化、反應介質體系以及生物酶反應器的設計和綜合考慮，對實現硫醚底物的高效不對稱氧化反應的潛在的過程化和工業化的研究均具有重要意義。

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