陳皮總黃酮測定方法及水提取動力學模型的建立

夏振文 趙陽 張欣 楊春靜 薛丹 尹興斌 倪健

陳皮(Citri Reticulatae Pericarpium)為蕓香科植 物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，是一種藥食同源的中藥。陳皮辛、苦，溫，歸脾、肺經，具有理氣健脾，燥濕化痰的功效，主治脘腹脹滿，食少吐瀉，咳嗽痰多等癥。現(xiàn)代科學研究表明，陳皮含有很多化學成分，主要有黃酮類化合物、揮發(fā)油類、檸檬苦素類、生物堿類和微量元素(鈣、鉀、鎂、鈉、鋰、鐵、鋅、錳)等［2］。

黃酮作為陳皮中一大類主要活性成分，種類繁多，主要包括橙皮苷(陳皮苷、橘皮苷)，新陳皮苷、川陳皮素(蜜橘黃素)、柚皮苷元(柑橘素)、二氫川陳皮素、紅橘素等［3］，現(xiàn)代研究表明黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、防癌、抗菌、抗炎、抗病毒、抗過敏及抗糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性及藥理作用，且無毒無害，對腫瘤、心血管病等多種疾病的治療和預防有重要意義。由此可見，陳皮中總黃酮具有很好的開發(fā)前景和利用價值，有必要對陳皮中總黃酮的提取進行研究。參考本課題組已建立的黃酮類成分的提取動力學模型［6-10］，本實驗對陳皮中總黃酮的水提取動力學過程進行了研究，建立陳皮總黃酮成分水煎煮提取的動力學模型，以擴大提取動力學方程的適用范圍，建立黃酮類成分普適的提取預測模型的驗證，豐富數(shù)據庫資源，提高預測準確性。

1 儀器與藥物

陳皮藥材(生產批號:401003645，北京同仁堂有限責任公司)，由北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定系劉春生教授鑒定;橙皮苷對照品(生產批號:1807/16335，純度＞98%，月旭材料科技上海有限公司);Tu180型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);DZKW-4型水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);甲醇為分析純(北京化工廠)，水為蒸餾水。

2 方法

2．1 陳皮總黃酮測定方法的建立

2．1．1 對照品溶液和供試品溶液的制備 精密稱取橙皮苷標準品11．78 mg到50 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，得到0．2356 mg/mL的橙皮苷標準品溶液。取陳皮15．00 g，加300 mL蒸餾水回流提取60分鐘，濾過，得陳皮水提液作為供試品溶液。

圖1 橙皮苷、陳皮水提液紫外吸收光譜圖

2．1．2 測定波長的選擇 取上述2種溶液，取適量蒸餾水稀釋后用紫外可見分光光度計在紫外區(qū)(190～600 nm)進行掃描，結果，供試品溶液在28～285 nm處均有最大吸收，而橙皮苷標準品溶液在284 nm處有最大吸收，故選定284 nm作為測定波長［5］。

2．1．3 標準曲線的測定 精密吸取上述橙皮苷標準品溶液 0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．5 mL 分別置于10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，以相應蒸餾水溶液為空白對照，在284 nm處測定其吸光度。結果表明，在0．004712～0．03534 mg/mL范圍內，吸光度(Y)和橙皮苷質量濃度(X)呈良好線性關系，其回歸方程為:Y=30．877X －0．0072，r=0．9991。

2．1．4 精密度實驗 取濃度為0．2356 mg/mL的橙皮苷溶液0．8 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，重復進樣6次，計算其RSD為0．0876%，表明精密度良好。

2．1．5 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于配置后 10、20、30、40、50、70、90、120、150 分鐘進行含量測定，測定其吸光度并計算 RSD為0.15%，試驗證明穩(wěn)定性良好。

2．1．6 重復性實驗 取15．00 g陳皮藥材，加水300 mL回流提取60分鐘，濾過，取提取液100μL至10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，測定含量，以上實驗重復進行6次，計算相對標準偏差，結果RSD為1．29%，試驗證明重復性良好。

2．1．7 回收率實驗 精密稱取陳皮藥材1．00 g，置50 mL的圓底燒瓶中，再分別加入橙皮苷標準品1.698 mg，加20 mL蒸餾水，回流提取30分鐘，提取液放冷，取續(xù)濾液60μL至10 mL量瓶中，平行6份，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，進行含量測定。以上實驗重復進行6次，結果平均回收率99．98%，RSD 為1．77%。

可以看出，所建立的陳皮總黃酮測定方法的各項方法學考察符合規(guī)定，因此根據此方法對其水提過程中的陳皮總黃酮含量進行考察，建立其提取動力學模型并進行驗證。

2．2 陳皮水提取動力學模型的研究

2．2．1 基于FICK定律得到的中藥材提取通用的動力學模型 基于FICK定律以及希格比理論對提取過程的微觀闡釋，同時也根據實際應用的需求，選取重要的影響因素如提取時間、溶劑倍量、顆粒粒度作為實驗參數(shù)，簡化或轉化復雜的非必求參數(shù)例如傳質系數(shù)、藥材密度、顆粒數(shù)目，以減小方程的復雜程度。但文獻中應用到的方程大都存在方程形式復雜，需要求解的參數(shù)過多，且求解困難這一問題，因此欲建立與實際生產相適應的模型，就必須解決上述問題，通過一系列假設和數(shù)學推導最終得到中藥材提取通用的動力學模型［6-7］:

它表示了煎煮出的有效成分濃度與提取時間、溶劑倍量及顆粒粒度之間的函數(shù)關系。CB為提取液中目標成分的質量濃度，單位為mg/mL。M為溶劑倍量，單位為mL/g。σ對于性狀不同的飲片代表不同的含義，對于葛根這種近似為正方體形的藥材，其代表飲片的一個邊長，單位是μm。f為方程中的一個固定參數(shù)，與藥材中目標成分的含量有關。R為干藥材的吸溶劑率，由于本實驗使用溶劑為水，即為藥材的吸水率。n值與擴散系數(shù)有關，值為負。

2．2．2 理論基礎 由于中藥材飲片多數(shù)存在形狀不規(guī)則的問題，故每味藥材的粒徑值即σ1是不易通過實驗的方式確定的(除了少數(shù)形狀比較規(guī)則的中藥飲片如葛根等)。另外，在實際生產中，藥材多以飲片投料，粒徑這一因素是固定不變的。所以有必要對方程進行簡化，將σ1這個參數(shù)由需要實驗直接測定轉變?yōu)樽罱K固定參數(shù)a當中的一部分。這樣減少藥材粒徑的直接測定能夠增加模型的準確性，擴大模型的適用范圍，并且和實際生產情況更加接近。因此根據合理的數(shù)學推導［8］，得到了簡化后的模型:

兩邊同時取對數(shù)可以得到:

通過對不同時間和溶劑倍量作為自變量［t1/2/(M-R)］，提取液濃度CB為因變量。分別代入上述方程中，可以求得a和n值。從而得到提取動力學方程進行預測。

2．3 陳皮模型方程建立試驗方法

分別取藥材約 2．00、4．00、8．00、12．00、16．00、20．00 g置于500 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300 mL，加熱回流60分鐘，濾過，取出稱重。以藥材濕重與干重的差值為Y對藥材干重X做線性回歸，回歸方程的斜率即為中藥材吸收溶劑率R。平行進行3次，求算其平均值，求得陳皮的吸水率R為 2．8401 mL/g。

2．3．2 提取時間對提取率的影響 采用圓底三口燒瓶，電熱套加熱進行水煎煮提取，為減少水分蒸發(fā)，安裝了回流冷凝裝置。固定溶劑倍量 M=12 mL/g，在提取時間點為10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘時分別取出5 mL提取液后再補充5 mL。提取液放冷，待測;固定溶劑倍量M=16 mL/g，在提取時間點為10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘分別取出5 mL提取液后再補充5 mL。提取液放冷，待測。

2．3．3 溶劑倍量對提取的影響 固定提取時間為20分鐘，分別于 10、12、14、16、18 和 20 溶劑倍量下，取出一定體積提取液，放冷，待測;固定提取時間為40 分鐘，分別于不同10、12、14、16、18 和20 溶劑倍量下，取出一定體積提取液，放冷，待測。

3 結果

3．1 提取時間和溶劑倍量對提取的影響結果

采用上述建立的紫外分光光度法進行含量測定。對上述所有提取數(shù)據進行整理，求得ln［t1/2/(M-R)］和ln CB進行線性回歸。結果見表1，圖2。

3．2 模型的檢驗結果

把圖2中的回歸方程和(1-3)式中相應數(shù)值聯(lián)立，1/(1 － n)=0．5902，1/(1 － n)lnαf1=1．2506?？梢郧蟮?n= －0．6943，α =92．9600，代入(1-2)式中求得本次研究所建立的陳皮總黃酮水煎煮提取過程 動 力 學 模 型:CB=(8．3223 × t0．5/M － 2．8401)0．5902。根據所建立的動力學方程式，可以計算出不同提取時間、不同溶劑倍量條件下陳皮水提液中總黃酮的濃度，計算結果見表2。

以上檢驗數(shù)據表明，本次研究所建立的動力學模型能比較好地與試驗結果相吻合，各條件下的試驗數(shù)值與計算數(shù)值的標準偏差基本能滿足工業(yè)標準偏差要求(小于10%)。

表1 不同t和M下的提取結果

圖2 ln［t1/2/(M－R)］和ln CB回歸方程

表2 模型檢驗結果

4 討論

本實驗陳皮總黃酮的測定方法精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率均符合要求，穩(wěn)定可行，可以用于陳皮總黃酮的測定。推導出的提取動力學模型對陳皮總黃酮的水提過程也有很好的適用性。但在實驗中發(fā)現(xiàn)，超過一定范圍后預測誤差就會偏大，實驗中超過80分鐘后，濃度增長很緩慢。分析原因可能是因為陳皮果皮質地柔軟，總黃酮的成分容易煎出，因此陳皮煎煮過程中溶液能較快的達到飽和。在工業(yè)生產時，綜合考慮到效率、能耗，一次提取時間不長，因此本動力學模型具有一定的參考價值［11］。

由實驗結果可知，陳皮中總黃酮測定，通過簡化后的模型，對兩邊同時取對數(shù)，得到了提取液濃度與提取時間和溶劑倍量之間的線性關系。然后在此基礎上求解a和n更加方便，同時可以根據所有實驗數(shù)據回歸得到整體擬合度更高的回歸方程，把兩個因素之間共同作用的關系體現(xiàn)出來。相比課題組之前［6-8］研究中選擇的求取n、a平均值更能反映整體趨勢。

黃酮類成分藥材的提取動力學模型的建立和推廣，可以為含黃酮類成分中藥材的提取工藝標準化、最佳化提供理論基礎和應用工具。通過建立的動力學模型，可以快速判斷各因素變化對提取物質量的影響，不僅可以減少提取環(huán)節(jié)的研究周期，降低成本和消耗，而且可以規(guī)范中藥提取行為，保證提取物質量的穩(wěn)定性、一致性。由黃酮類成分提取動力學模型可以推測，中藥中其他幾大類的成分(如生物堿、皂苷、甾體類，多糖等)的提取也可能適用此提取動力學模型，這有待于后續(xù)研究證明。

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