p53 抑癌基因電化學阻抗傳感器研究*

杜芳靜，胡曉琴，宋 珂，李曉霞

(延安大學 化學與化工學院，陜西 延安716000)

0 引 言

電化學DNA 傳感器(elctrochemical DNA sensor)是將探針DNA 固定在電極表面上，通過檢測電化學信號進行分析的器件。此類傳感器具有簡單、靈敏、快速、低成本及低能耗等特點，在疾病診斷、環境檢測和食品安全等領域有著重要的應用價值和廣闊的應用前景［1～3］。p53 抑癌基因(p53－DNA)是生物體內一種抑制細胞轉變癌細胞的基因，可誘導細胞生長阻滯，細胞凋亡，細胞分化以及DNA 修復［4］。目前已報道p53－DNA 的分析方法有電化學法［5～7］、光學法［8］和免疫法［9］。電化學阻抗(elctrochemical impedance spectroscopy，EIS)技術是利用小幅度交流電壓或電流對電極擾動，測量體系對擾動跟隨情況的電化學響應的測量方法，該方法具有頻率范圍廣、對體系擾動小等特點，是研究電極過程動力學、電極表面現象等的重要工具［10，11］。

本文基于電化學阻抗技術構建了一種檢測p53－DNA的電化學傳感器，將末端帶巰基的探針p53－DNA 固定于金電極表面，根據傳感器結合前后電子轉移阻抗值的變化，對目標p53－DNA 進行了分析與測定。該傳感器制備簡單、靈敏高，且無需標記，易于操作，可用于不同序列DNA 的研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華);Q5200B超聲儀(江蘇昆山);HG—9140A 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏設備);電極系統:Au 為工作電極，Ag/AgCl 電極為參比電極，Pt 為對電極。

鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀(西安化學試劑廠);單鏈DNA(上海生工)序列參見文獻［5］;單鏈DNA 儲備液:用pH 7.0，10 mmol/L PBS 緩沖溶液配制;5.0 mmol/L K3［Fe(CN)6］－5.0 mmol/L K4［Fe(CN)6;檢測液:用pH 7.4，0.10 mol/L PBS－0.10 mol/L NaCl 配制;實驗用水均為Millipore Milli—Q 超純水(大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 實驗方法

首先將Au 進行預處理［12］。將5 μL 5.0 μmol/L 探針p53－DNA 溶液滴涂在處理好的Au 表面，4 ℃固定12 h，然后用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超純水沖洗，以除去吸附的探針;用5.0 μL，1.0 mmol/L MCH 封閉1 h，得到p53－DNA傳感器，4 ℃冰箱中保存待用。將5.0 μL 不同濃度目標p53－DNA 滴加到p53－DNA 傳感器上，37 ℃雜交反應1 h。在5.0 mmol/L/L K3［Fe(CN)6］－5.0 mmol/L K4［Fe(CN)6］檢測液中進行測定，根據傳感器雜交前后電子轉移阻抗值的變化分析信號，對目標p53－DNA 進行定量檢測。

2 結果與討論

2.1 傳感器的電化學表征

圖1 為不同修飾電極在檢測液中的循環伏安圖。曲線a 為裸 Au 電極上的循環伏安曲線，結果發現，［Fe(CN)6］3－/4平衡電對的電位差為80 mV。探針p53－DNA 自組裝到Au 電極表面后，由于DNA 的磷酸骨架帶負電荷，阻礙荷負電的［Fe(CN)6］3－/4－的電子傳遞，峰電位差ΔE 明顯增大且峰電流降低(曲線b)。當封閉劑MCH 占據了電極表面未結合的位點(曲線c)，峰電位差繼續增大且峰電流也繼續降低。探針DNA 與目標DNA 雜交之后形成雙鏈DNA 結構(曲線d)，峰電位差達到最大，峰電流降到最低。以上結果表明:探針DNA 通過巰基自組裝作用固定在電極表面，構建的p53－DNA 傳感器與目標p53－DNA 發生了雜交反應。

圖2 為不同電極的電化學阻抗圖。可以看出，曲線a為裸金電極的阻抗，半圓較小，其電子傳遞阻抗Ret值為73.2 Ω。當探針DNA 固定到電極表面后，［Fe(CN)6］3－/4－電子傳遞受阻，電子傳遞阻抗Ret值增大到3 846 Ω。MCH封閉后，電子傳遞阻抗Ret值繼續增大，說明MCH 在電極表面上形成致密的自組裝膜，使得［Fe(CN)6］3－/4－電子傳遞變得更加困難。當雜交反應形成DNA 雙螺旋結構，進一步阻礙了［Fe(CN)6］3－/4在電極表面的電子傳遞，因此，其電子傳遞阻抗Ret值達到9 271 Ω。阻抗法與循環伏安法表征的結果一致，說明DNA 傳感器制備成功，并可以用于目標p53－DNA 的檢測。

圖1 不同電極在5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-溶液中的循環伏安圖(cProbe DNA=5.0 mol/L，cTarget DNA=1.0 mol/L)Fig 1 Cyclic voltammograms of different electrodes in 5.0 mmol/L M［Fe(CN)6］3-/4-solution(cProbe DNA=5.0 mol/L，cTarget DNA=1.0 mol/L)

圖2 不同電極在5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-溶液中的阻抗圖Fig 2 Impedance diagram of different electrodes in 5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-solution

2.2 實驗條件的選擇

為了獲得更高的靈敏度，首先考察了各種電化學參數對傳感器的影響。首先研究了不同的電化學技術對靈敏度的影響，將制備好的傳感器放入5×10－7mol/L，1×10－6mol/L兩種不同濃度目標p53－DNA 溶液中，分別采用電化學阻抗法、微分脈沖伏安法和方波伏安法進行測定，實驗結果說明使用電化學阻抗法測定靈敏度更高。因此，選用電化學阻抗法對目標p53－DNA 進行測定。圖3 為探針DNA 不同固定時間與傳感器雜交前后電化學阻抗變化值的關系曲線，可以看出，隨著固定時間從8 h 增加到12 h，電子傳遞電阻值Ret逐漸增大，12 h 之后Ret值呈緩慢降低，說明探針固定12 h 趨于飽和。因此，實驗選擇探針固定時間為12 h。

圖3 探針固定時間對傳感器響應信號的影響Fig 3 Effect of immobilization time of probe on response signal of sensor

考察了雜交溫度和雜交時間對傳感器測定的影響，結果表明:雜交溫度達到37 ℃時，電化學阻抗響應信號是最大的(圖4(a))，37 ℃之后呈下降的趨勢，說明在較高溫度時，DNA 變性導致DNA 分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構，不利于雜交［13］，所以，選擇37 ℃為最佳雜交溫度。圖4(b)顯示了當雜交時間達到1 h 時，Ret值最大，繼續增加雜交時間，其Ret值變化較小，因此，選擇DNA 雜交時間為1 h。

圖4 雜交溫度和雜交時間對響應信號的影響Fig 4 Effect of hybridization temperature and time on response signal

2.3 分析性能

在上述優化的實驗條件下，利用制備好的傳感器對一系列不同濃度的目標p53－DNA 進行定量測定。圖5 為傳感器在不同濃度目標p53－DNA 溶液中的電化學阻抗圖。電子傳遞電阻Ret與目標p53－DNA 濃度在1×10－8～1×10－6mol/L 范圍內呈線性關系(見附圖)，線性回歸方程為Ret(Ω)=37.74+4.666 7 C(C(mol/L))，相關系數為0.995 5，其檢出限為3.0×10－9mol/L(S/N=3)。對5.0×10－8mol/L的目標p53－DNA 做11 次平行測定，相對標準偏差為3.8%。比較發現，本文方法測定線性范圍較文獻［7］寬，測定方法較文獻［5］更簡單。

2.4 選擇性

利用制備好的DNA 傳感器對完全互補p53－DNA、單堿基錯配序列p53－DNA 和三堿基錯配序列p53－DNA 進行測定。結果表明:傳感器識別互補p53－DNA，其響應信號電子傳遞電阻Ret值為9 989 Ω，與單堿基錯配p53－DNA 反應后，Ret值為4 495 Ω，與三堿基錯配p53－DNA 反應后，Ret值為2 297 Ω，分別為完全互補的DNA 雜交信號的45%和23%。說明該傳感器能夠區分完全互補序列、單堿基錯配序列和三堿基錯配序列DNA，具有良好的選擇性。

3 結 論

圖5 傳感器檢測不同濃度目標DNA 的電化學阻抗圖(插圖為電子傳遞電阻Ret vs 目標p53-DNA 濃度)Fig 5 Electrochemical impedance diagram of biosensor detect different target DNA concentrations(Insert:Plots of the difference of electron transfer resistance(Ret)vs logarithmic of target p53-DNA concentration)

本文基于電化學阻抗技術構建了一種檢測p53－DNA的電化學傳感器，該傳感器可以檢測完全互補DNA 的范圍是1.0×10－8～1.0×10－6mol/L，具有操作簡單、無需標記、靈敏度高的優點，可以用于其它DNA 序列的檢測。

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