生長期和pH值對格氏鏈球菌自溶酶atlS基因表達的影響

劉敏 閆嘉惟 劉婭玲 郝玉慶

1.濱州醫學院附屬醫院口腔內科，濱州 256603；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院（四川大學），成都 610041；3.成都市第五人民醫院口腔科，成都 610041

自溶酶是革蘭陽性菌產生的一種細胞壁肽聚糖水解酶。目前，細菌自溶酶的作用與調控機制已成為致病性生物膜研究的熱點之一，但對于有益菌自溶酶的研究甚少，而有益菌自溶酶對細菌生存競爭與生物膜生態平衡可能具有重要作用[1]。

口腔有益菌格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii，S.gordonii）是菌斑生物膜最早期的定植菌之一，在健康菌斑中占有相當高的比例，對維護菌斑的生態平衡具有重要意義[2]。S.gordoniisg2013蛋白是形成正常細胞壁結構、生物膜及細菌自溶酶的關鍵蛋白。該蛋白能夠水解S.gordonii細胞壁的肽聚糖，具有自溶酶功能，命名為AtlS[3]。研究[3]發現，AtlS對細菌生存競爭及拮抗致齲菌有重要作用。基于AtlS在S.gordonii生存競爭及拮抗致齲菌具有重要作用以及氧和pH值對細菌生長的影響，本實驗運用熒光定量聚合酶鏈反應（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）的方法研究S.gordonii的atlS基因在不同生長期及pH值的表達差異，進而分析調控S.gordoniiatlS表達的因素。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株和培養基

S.gordoniiATCC 35105購于美國標準品收藏中心。腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養基（Oxoid公司，英國）；兩種TY（tryptone yeast）培養基，一種pH=7.0，由50 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液配制；另一種pH=5.5，由6 mol·L-1鹽酸配制。

1.2 主要儀器及設備

YJ-875型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），7300型FQ-PCR儀（Applied Biosystems公司，美國），Hermle Z323K型低溫離心機（Hermle Labartechnik公司，德國），SPΕCTRONIC 200型分光光度計（Thermo Fisher公司，美國），pH計（Mettler Toledo公司，瑞士），Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗菌株的培養 1）BHI培養基中實驗菌株的培養。S.gordoniiATCC 35105于37 ℃下置于BHI瓊脂培養基中復蘇，兼性厭氧（80% N2、10% H2、10% CO2）條件下培養24 h后傳代，接種于液體BHI培養基，37 ℃兼性厭氧培養12 h，備用。2）TY培養基中實驗菌株的培養。S.gordoniiATCC 35105于37 ℃下置于BHI瓊脂培養基中復蘇，兼性厭氧培養24 h后分別接種于TY/pH7.0和TY/pH5.5培養基中傳代，37 ℃兼性厭氧培養12 h，備用。

1.3.2S.gordonii生長曲線的測量 將S.gordonii培養物調整到相同的菌密度后，一式三份分別接種于含有50 mL BHI、TY/pH7.0和TY/pH5.5培養基的錐形瓶中，混勻菌液，在96孔板上分3組，每組3孔，每孔加菌液200 μL，培養24 h。用自動酶標儀每小時測量1次光密度（optical density，OD）值，重復3次，繪制24 h生長曲線，確定S.gordonii的生長期。

1.3.3S.gordonii樣本收集 以BHI作為培養基，分別在S.gordonii對數生長早期、對數生長中期、對數生長晚期及生長穩定期收集細胞。將TY/pH7.0和TY/pH5.5培養基分別植入菌液后置于37 ℃有氧搖床（速度為150 r·min-1）上培養，收集S.gordonii生長穩定期細胞；其中TY/pH7.0培養基作為中性條件，TY/pH5.5培養基作為酸性條件。

1.3.4 FQ-PCR檢測atlS基因mRNA表達水平S.gordonii收集完成后，采用FQ-PCR方法檢測atlS基因在不同生長期（對數生長早、中、晚期和穩定期）和不同pH值（7.0和5.5）條件下mRNA的表達水平。1）RNA提取和cDNA合成。按Trizol總RNA抽提試劑說明書分別對不同生長期和不同pH值下收集的S.gordonii進行RNA提取，按照Fermentas逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，-20 ℃保存。2）引物設計。采用S.gordoniiATCC 35105的16S rRNA基因為內參。根據參考文獻[4]中得到的S.gordoniiATCC 35105的atlS基因片段核苷酸序列，利用Primer5.0軟件設計引物，序列如下。atlS基因引物，F：5’-CAGTCATAACGGAAGCATAAGC-3’，R：5’-CACTTGCAAACCAGCCAACTGG -3’，產物154 bp；16S rRNA內參[5]引物，F：5’-AAGCAACGCGAAGAACCTTA-3’，R：5’-GTCTCGCTAGAGTGCCCAAC-3’ ，產物195 bp。設計的引物在GenBank上用BLAST程序檢測其特異性，結果顯示與S.gordonii的atlS基因的匹配率最高。3）FQ-PCR擴增。采用TaKaRa公司的SYBR?Premix Εx TaqTMⅡ（Perfect Real Time）試劑盒，操作按說明書進行，反應體系總體積為20 μL。用RNase Freed H20將每個cDNA樣本稀釋5～10倍，置于7300型FQPCR儀上，進行PCR反應，每組的目的基因atlS與內參基因16S各設 3個平行管。讀取各樣本Ct值。4）瓊脂糖電泳。取5 μL PCR擴增產物，加1 μL 6×Loading Buffer，在1.2%瓊脂糖凝膠，1×TBΕ緩沖液中電泳35 mins，電壓為100 V，電流為80 mA，采用Bio-Rad凝膠成像系統觀察并記錄。5）數據分析。atlS基因mRNA的相對表達量用2-ΔΔCt法計算。不同生長期和不同pH條件下的ΔCt計算公式如下：ΔCt=atlS基因Ct值-16S rRNA Ct值。對不同生長期的分析中，以對數生長早期為對照組；對不同pH條件下分析中，以TY/7.0為對照組。ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組，計算得出atlS基因mRNA的相對表達量。使用SPSS 16.0統計軟件進行分析，兩組間的比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 S.gordonii的生長曲線

S.gordonii在BHI和TY/pH7.0、TY/pH5.5培養基中的生長曲線見圖1、2：該細菌的對數生長早期為3 h，對數生長中期為4 h，對數生長晚期為5 h，穩定期為7 h；在中性和酸性條件下到達穩定期的時間分別為7 h和8 h。

圖1 BHI培養基中S.gordonii的生長曲線Fig 1 The growth curve of S.gordonii in BHI culture medium

圖2 TY培養基中S.gordonii的生長曲線Fig 2 The growth curve of S.gordonii in TY culture medium

2.2 atlS基因mRNA的相對表達量分析

atlS基因在不同生長期和pH值下的相對表達量見圖3、4。經統計學檢驗，在不同生長時期atlS基因的相對表達量均有差異（P＜0.05），可以認為從對數生長早期到穩定期該基因的表達逐步升高；在中性和酸性條件下表達量的差異也有統計學意義（P＜0.05），中性條件下的表達量高于酸性條件下。

圖3 S.gordonii在不同生長期atlS基因表達差異Fig 3 Differential expression of atlS gene of S.gordonii at different growth stages

圖4 S.gordonii在不同pH值下atlS基因表達差異Fig 4 Differential expression of atlS gene of S.gordonii at different pH value

3 討論

齲病是最常見的人類感染性疾病之一，屬于生態失衡性疾病，其發生與菌斑生物膜密切相關。如何維護菌斑的生態平衡是齲病防治的關鍵，有效的抗齲治療不能對有益的共生菌造成危害，因此自溶途徑有望成為抗齲治療的潛在靶點[6-7]。

2006年，H?varstein等[8]發現肺炎鏈球菌自溶酶LytA與細菌壓力耐受密切相關。在酸性、抗生素等多種壓力下，LytA表達增強，作為分泌蛋白溶解其他細菌的同時產生保護機制使自身免于溶解；通過清除“老弱病殘”的同種細菌并拮抗其他種類的細菌，同時獲得外源性DNA與生長所需營養物質，減少細菌間的競爭壓力[8-9]。LytA的作用機制被認為是肺炎鏈球菌應對環境壓力的重要應答反應，對細菌的生存競爭具有重大意義[8,10-11]。

有研究發現，S.gordonii通過產生多種蛋白水解酶、過氧化氫及細菌素可抑制變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）的過度生長與毒力因子的產生[5]；臨床研究也證實，當牙菌斑生物膜中檢出高比例的S.gordonii時，變異鏈球菌產酸及細菌毒力作用能夠被有效地抑制[12]。AtlS是S.gordoniisg2013蛋白，因其能夠溶解S.gordonii的細胞壁肽聚糖而命名。Liu等[3]已經證實，S.gordoniiatlS與細菌形成感受態、耐酸耐氧密切相關，在培養了48 h的S.gordonii生物膜中可以檢測到大量的AtlS蛋白，提示AtlS可能在菌斑生物膜中大量釋放。在與變異鏈球菌的生存競爭實驗中發現，加入AtlS重組蛋白可以明顯提高S.gordonii拮抗S.mutans的能力[3]。由此推測，S.gordoniiAtlS的作用機制可能與肺炎鏈球菌LytA相似。

細菌的存在是齲病發生的先決條件，口腔中主要的致齲菌是S.mutans，它具有極強的產酸、耐酸及附著能力。菌斑中的S.mutans可使局部pH值下降至5.5以下，并能維持相當長的時間，同時避開唾液的緩沖作用，從而造成局部脫礦。在口腔鏈球菌中，S.gordonii是有益菌，具有拮抗S.mutans的作用。S.gordonii的atlS基因與S.mutans的atlA基因有36%的同源性。S.mutans的atlA基因與其生物膜形成有重要關系[13]，由此推測，atlS與S.gordonii的生物膜形成或許也有相關性[6]。

基于atlS基因在S.gordonii生存競爭及拮抗致齲菌中表現出來的重要作用，本實驗運用FQ-PCR法研究S.gordonii的atlS基因在不同生長期及pH值下的表達差異，結果顯示，細菌生長期和pH值是影響atlS基因表達的相關因素。在不同的生長期（對數生長早期、對數生長中期、對數生長晚期、穩定期）和不同pH值（7.0和5.5）下atlS基因均有表達，且表達量高低存在差異。從對數生長早期到穩定期，atlS基因表達量呈上升趨勢，到穩定期達到最高水平；中性條件下的表達量高于酸性條件。

本實驗發現，S.gordoniiatlS基因在細菌生長的不同階段表達具有差異性，從對數生長早期到穩定期呈增長趨勢。當細菌生長到穩定期時，細菌量達到最高值，atlS基因的表達也在穩定期達到最高，這可能與細菌數量不斷增多有關。

菌斑在齲病的發生過程中起重要的作用是因為菌斑中可以積聚酸，當pH值下降到臨界值（5.5）以下時，可造成羥磷灰石中的鈣丟失，釉質脫礦。只有少數致齲菌如S.mutans可以在這種環境下繼續生長并產酸[7,14]。Liu等[3]發現，AtlS可以增加S.gordonii的耐酸性，atlS缺陷株在酸性條件下不能生長。本實驗發現，在中性或酸性條件下atlS基因都可以表達，但是atlS基因在臨界pH值（5.5）時的表達不如其在中性條件下高，這可能會降低了當口腔處于易患齲環境時對S.mutans的拮抗作用。

本研究顯示，pH值和細菌生長期均能影響atlS的表達，但需要進一步排除各種因素間的相互干擾，篩選調控atlS表達的主要因素并明確其作用機制，及以上因素對AtlS蛋白水解酶活性的影響。另外，還需篩選并驗證調控atlS表達的關鍵分子通路，以了解外界因素是通過怎樣的分子網絡進行信號傳遞以調控atlS基因的表達。

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