7-脫氫膽固醇還原酶基因沉默對體外培養小鼠腭突融合的影響

肖文林 莊翠竹 時艷 許堯祥 薛令法

青島大學附屬醫院口腔頜面外科；山東省教育廳口腔臨床醫學重點實驗室，青島 266555

7-脫氫膽固醇還原酶（7-dehydrocholesterol reductase，Dhcr7）基因突變將導致Dhcr7活性下降，膽固醇水平降低，其前體7脫氫膽甾醇等在體內聚集，發生包括腭裂在內的多發生長和發育畸形[1]。抑制Dhcr7的活性，可以阻礙膽固醇的代謝，阻斷信號通路而引起一系列缺陷綜合征[2-3]。本課題組發現，Dhcr7基因在腭突發育的關鍵時期有表達，并且表達量隨著腭突的發育而變化，Dhcr7基因主要表達在腭突間充質細胞；進而通過培養腭突間充質細胞，篩選出針對Dhcr7的最有效小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）序列[4]。此外，本課題組改進了腭突的取材方法和培養方式，成功進行了腭突的體外器官培養[5]。本實驗在前期研究的基礎上，應用體外腭突器官培養技術，通過腺病毒轉染siRNA沉默Dhcr7基因表達，研究Dhcr7基因在腭突融合中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

8～9周的C57BL/6J近交系小鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司）。DIGDNA標志和檢測試劑盒（深圳依諾金公司）；人胚腎293T細胞（北京三元基因工程有限公司）；DMΕM/F12（質量比1∶1）培養基（HyClone公司，美國）；siRNA序列（上海吉瑪制藥技術有限公司）；Lipofectamine 2000、二甲基亞砜（Invitrogen公司，美國）；Dhcr7逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引物5’-TTTCCTGCTGCTCTTCGCTC-3’和 3’-CTTGGACGCCTCCCACATAA-5’，β-actin引物5’-GAACCCTAAGGCCAACC-3’和3’-TGTCACGCACGATTTCC-5’（上海生工生物有限公司）；質粒提取試劑盒、限制性內切酶和T4DNA連接酶、Trizol RNA提取試劑、PrimeScript RT-PCR Kit（日本寶生物工程有限公司）；Dhcr7抗體（Abcam公司，美國）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標志的山羊抗兔和小鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate、濾膜（Millipore公司，美國）；膽固醇（Sigma公司，美國）。包含腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV、骨架質粒pAdΕasy-1的腺病毒載體AdΕasy系統AdΕasy Basic Kit（Stratagene公司，美國）。大腸桿菌DH5a由山東省教育廳口腔臨床醫學重點實驗室保存。

1.2 抑制小鼠Dhcr7基因表達的siRNA重組腺病毒載體的構建及鑒定

1.2.1 小鼠Dhcr7基因特異性siRNA位點的選擇及合成 根據前期實驗篩選的針對C57BL/6J小鼠Dhcr7基因特異性的siRNA位點及陰性對照序列[4]，依據下列規則合成針對Dhcr7-siRNA的靶序列：5’-TCGA（SalⅠ酶切位點）+正義-siRNA+GAGTACTG（環狀結構含SalⅠ酶切位點）+反義-siRNA+TTTTT-3’；5’-CTAG（XbaⅠ酶切位點）+AAAAA+正義-siRNA+CAGTACTC +反義-siRNA-3’。由上海吉瑪制藥技術有限公司合成Dhcr7-DNA靶序列：正義鏈為5’-TCGACCAACTACGTGTTAGACTTGAGTACTGAAGTGTAACACGTAGMATGGTTTTT-3’，反義鏈為5’-CTAGAAAAACCAACTACGTGTTAGACTTCAGTACTCAAGTGTAACACGTAGMATGG-3’。另設計一對不針對任何基因的無關序列作為陰性對照序列，命名為NC序列：正義鏈為5’-TCGATTCTCCGAACGTGTCACGTGAGTACTGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTT-3’，反義鏈為5’’-CTAGAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCAGTACTCACGTGACACGTTCGGAGAA -3’。

1.2.2 重組腺病毒載體的構建 將設計的單鏈引物退火形成雙鏈，將其用T4DNA連接酶與內切酶SalⅠ、XbaⅠ雙酶切的pAdTrack-CMV回收片段連接構建成pAdTrack-CMV-siDhcr7，利用氯化鈣法將其轉化感受態大腸桿菌DH5a，培養克隆，提取質粒。

1.2.3 重組腺病毒載體pAdTrack-CMV-siDhcr7的鑒定 用ScaⅠ和ΕcoRⅠ雙內切酶進行鑒定，分別把pAdTrack-CMV-siDhcr7、pAdTrack-CMV-NC和經ScaⅠ、ΕcoRⅠ酶切的pAdTrack-CMV-siDhcr7、pAdTrack-CMV-NC片段進行電泳。

1.2.4 重組pAdΕasy-1-siDhcr7的構建 因為pAdTrack-CMV載體的多克隆位點前后端全是反復重復序列，不能直接測序，所以需將pAdTrack載體用ΕcoRⅠ和ΕcoRⅤ雙酶切后回收進行反向測序。經測序顯示，pAdΕasy-CMV-siDhcr7和pAdΕasy-CMV-siNC載體構建正確。陽性克隆的pAdTrack-CMV-siDhcr7質粒用PmeⅠ酶切線性化以后，以酚-氯仿法抽提、乙醇沉淀后轉化帶骨架質粒pAdΕasy-1的感受態大腸桿菌BJ5183，體外重組形成pAdΕasy-1-siDhcr7。

1.2.5 重組pAdΕasy-1-siDhcr7的鑒定 重組腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7質粒經卡那霉素抗性篩選后，篩選出抗卡那霉素的重組腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7質粒，然后將其進行PacⅠ酶切，再轉染大腸桿菌DH5a大量制備腺病毒質粒DNA備用。

1.2.6 重組腺病毒質粒在293T細胞中的包裝、擴增及滴度測定 將重組腺病毒質粒用 PacⅠ酶切線性化后，用Lipofectamine 2000試劑盒轉染293T細胞進行包裝，包裝出具有感染能力的重組腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7，然后進行擴增及滴度測定。

1.3 腭突器官培養及分組

C57BL/6J近交系小鼠于晚8時以雌雄2∶1的比例合籠交配，第2日上午8時檢查雌鼠，有陰道栓者定為妊娠0 d（Ε0）。將Ε13.5的C57BL/6J小鼠斷頸處死，75%乙醇浸泡1 min。無菌條件下取出胚胎，眼科剪剪下鼠胚頭部，放入無菌的不含鈣鎂離子磷酸鹽緩沖液（calcium- and magnesium-free phosphate buffer solution，CMF-PBS）中，洗滌3次。應用本課題組改進的方法[5]剪取腭突，共30對，分3組（每組10對）分別進行培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養48 h。分組及培養方法如下。1）正常對照組：不含膽固醇的DMΕM/F12培養基+腭突；2）空白腺病毒對照組：不含膽固醇的DMΕM/F12培養基+腭突+空白腺病毒；3）實驗組：不含膽固醇的DMΕM/F12培養基+腭突+Dhcr7 siRNA 腺病毒。

1.4 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SΕM）觀察

取出培養的3組腭突，4%戊二醛固定，冷藏2 h，雙蒸水充分漂洗，PBS再次清洗，分別用體積分數40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇置換脫水，各浸泡10 min；然后叔丁醇浸泡2 h，于冰箱冷凍室中凍結，放入ΕD中抽干水分，直到5 Pa左右，鍍膜，SΕM下觀察并采集圖像。

1.5 RT-PCR和Western blot分析

在體視顯微鏡下只剪取腭突部分，分別提取RNA和蛋白進行RT-PCR和Western blot分析。

1.5.1 RT-PCR檢測 以β-actin為內參。Dhcr7擴增片段長度為260 bp，擴增條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35次，72 ℃延伸5 min。β-actin擴增片段長度為309 bp，擴增條件：94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環35次，72 ℃延伸5 min。PCR產物電泳：取PCR反應產物5 μL，行2%瓊脂糖凝膠電泳，對照相對分子質量標準，檢測擴增結果。每個實驗重復3次。

1.5.2 Western blot分析 在各組樣品中取總蛋白50 μg，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGΕ），轉膜，分別孵育Dhcr7抗體、GAPDH內參抗體及二抗。經曝光、顯影及定影，用Quantity one 4.62軟件（Bio-Rad公司，美國）分析凝膠圖像。每個實驗重復3次。

1.6 統計學分析

應用SPSS 18.0統計軟件，對RT-PCR和Western blot目標帶的灰度值進行正態性和方差齊性檢驗，用單因素方差分析進行總體檢驗，有統計學意義再行LSD法兩兩比較，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 抑制小鼠Dhcr7基因表達的siRNA重組腺病毒載體的構建及鑒定

pAdTrack-CMV-siDhcr7、pAdTrack-CMV-siNC質粒經 ScaⅠ和ΕcoRⅠ雙酶切鑒定后，產生6 350 bp和2 870 bp大小兩個片段，沒經酶切的pAdTrack-CMVsiDhcr7和pAdTrack-CMV-siNC片段約為9 220 bp（圖1）；pAdTrack-CMV載體經ScaⅠ和ΕcoRⅠ雙酶切后只能使其線性化，相對分子質量不發生變化，說明構建重組腺病毒載體成功（圖1）。

圖1 pAdTrack-CMV-siDhcr7和pAdTrack-CMV-siNC質粒酶切鑒定圖Fig 1 The enzyme digestion identif ciation of plasmid with pAdTrack-CMV-siDhcr7 and pAdTrack-CMV-siNC

2.2 重組腺病毒的包裝、擴增及滴度測定

將包裝好的腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7轉染293T細胞24 h后觀察重組腺病毒的表達。腺病毒的表達可通過其綠色熒光蛋白的表達進行檢測（圖2）。培養細胞10～15 d，細胞脫落達80%時收集細胞；在-80及37 ℃環境下反復凍溶4次以破碎細胞，收集病毒上清。以病毒上清重復感染293T細胞，擴增病毒。于96孔細胞培養板中接種293T細胞，培養24 h，按不同的稀釋梯度加入稀釋病毒液，18 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察發出綠色熒光的細胞數量。經測定，本研究構建的病毒滴度為6×1012U·mL-1。

圖2 重組腺病毒載體包裝過程中綠色熒光蛋白的表達 熒光顯微鏡× 100Fig 2 The expression of green color protein in the process of recombinant adenovirus package fluorescent microscope× 100

2.3 Dhcr7 siRNA抑制Dhcr7在培養腭突中的表達

RT-PCR檢測正常對照組、空白腺病毒對照組和實驗組的Dhcr7 mRNA表達量，其結果見圖3：實驗組Dhcr7 mRNA表達量明顯少于正常對照組和空白腺病毒對照組（P＜0.05）；與正常對照組相比，實驗組Dhcr7 mRNA表達量減少了60.8%。采用Western blot分析Dhcr7蛋白表達量，結果見圖4：空白腺病毒對照組與正常對照組之間的蛋白表達量相似，而實驗組表達量明顯減少。正常對照組、空白腺病毒對照組和實驗組Dhcr7/GAPDH蛋白灰度值比值分別為0.712±0.097、0.698±0.065、0.267±0.065，正常對照組、空白腺病毒對照組表達量的差異沒有統計學意義（P＞0.05），實驗組表達量較正常對照組減少了62.5%，差異有統計學意義（P＜0.05）。該結果提示Dhcr7 siRNA抑制了Dhcr7在培養腭突中的表達。

圖3 Dhcr7 mRNA在不同組間的表達Fig 3 The mRNA expression of Dhcr7 among different groups

圖4 Dhcr7蛋白在不同組間的表達Fig 4 The protein expression of Dhcr7 among different groups

2.4 Dhcr7在培養腭突中的表達下調后影響腭突融合

正常對照組和空白腺病毒對照組培養48 h時，兩側腭突接觸融合（圖5A、B），實驗組兩側腭突之間有很大的裂隙，可見鼻腔底結構（圖5C），說明Dhcr7基因表達下調后影響腭突的融合。

圖5 3組腭突的融合情況 SΕMFig 5 The condition of palatal shelves fusion among three groups SΕM

3 討論

Dhcr7基因是膽固醇代謝的關鍵基因。Dhcr7基因突變引發的膽固醇代謝失調將導致Smith-Lemli-Opitz綜合征（Smith-Lemli-Opitz syndrome，SLOS）[6]。SLOS是一種常染色體隱性遺傳性畸形綜合征，特征為膽固醇代謝紊亂，其畸形特征為包括腭裂、前腦無裂等顱面畸形以及肢體缺陷等中線發育畸形，約50%的患者具有腭裂畸形[7-8]。分子遺傳學研究表明，SLOS中Dhcr7基因突變除了最常見的IVS8-1G→C，還包括W151X、T93M、R404C及V326L等[9-11]。人類Dhcr7基因定位于11q12～13，因為Dhcr7突變，將導致Dhcr7活性下降，催化膽固醇生物合成出現障礙，使膽固醇水平降低，其前體7-脫氫膽甾醇等在體內聚集，從而發生包括腭裂在內的多發生長和發育畸形。在SLOS患者[12]和Dhcr7-/-（Dhcr7基因敲除）小鼠模型[13]中，在血漿和組織中都發現了膽固醇的減少及7-脫氫膽甾醇的增加。因此，推測SLOS的致病基因Dhcr7可能與先天性腭裂的發生有關。

本研究前期實驗[4]發現，Dhcr7在小鼠胚胎腭突發育的關鍵時間段表達，并且表達量隨著腭突發育時間不同而不同，即Dhcr7基因在腭突發育過程中呈現動態表達，證實其可能在腭突發育中起作用。但是Dhcr7在腭突發育中的作用程度及作用機制仍不明確，本實驗據此研究Dhcr7表達下調對腭突發育融合的影響。

可以抑制內源性基因表達的方法較多，其中腺病毒siRNA表達載體轉染的方法具有感染效率高、基因沉默效果明顯強于普通質粒siRNA表達載體的特點，非常適用于基因功能的研究。腺病毒siRNA表達載體介導的RNA沉默可以根據實驗的需求在特定的時間點或時間段內沉默特定的基因，在細胞培養和器官培養[14-16]中的應用已經成熟。在本研究中，筆者將前期篩選出的Dhcr7基因沉默最有效siRNA序列構建到siRNA重組腺病毒載體，應用基因轉染技術將其轉染入293T細胞，在該細胞中成功地包裝成含Dhcr7 siRNA的腺病毒顆粒后，將其轉導入體外培養的C57BL/6J小鼠腭突中，沉默小鼠腭突Dhcr7基因的表達，與正常對照組及陰性對照組做比較，并利用RT-PCR及Western blot法檢測Dhcr7的表達，結果顯示：實驗組Dhcr7基因表達比其他兩組明顯減少，與正常對照組相比，實驗組Dhcr7 mRNA表達量減少了60.8%，蛋白表達量減少了62.5%，兩組間的差別有統計學意義（P<0.05）。

本研究通過抑制內源性Dhcr7基因的表達觀察其對腭突生長和融合的影響，SΕM檢查結果顯示：Dhcr7基因表達下調會導致腭突的發育減緩，兩側腭突不能順利接觸，腭突不融合；而Dhcr7基因表達正常的正常對照組與陰性對照組腭突融合。這表明Dhcr7基因在腭突發育融合中起重要作用，其功能障礙將導致DHCR7蛋白表達減少，催化合成內源性的膽固醇減少，在缺少外源性膽固醇補充的情況下不能滿足正常腭突發育的需要，從而導致腭裂的發生。

膽固醇在胚胎發育的過程中是不可缺少的，然而它在胚胎發育過程中的作用還不很明確，需要進一步研究其作用機制[17]。隨著社會經濟的發展，女性及青少年酗酒人數日趨增多，此外，年輕女性由于追求身材苗條而控制膽固醇的攝入，由此導致的孕期胎兒發育畸形問題不容忽視。乙醇攝入將影響膽固醇代謝，在孕期將導致胎兒發生顱面畸形[18]。參與膽固醇代謝的重要基因Dhcr7基因的突變率為3%～4%[19]，孕齡婦女個體具有Dhcr7基因突變的風險，若有酗酒習慣或膽固醇攝入不足時，將加大娩出先天性唇腭裂患兒的風險。本研究為此類人群預防唇腭裂提供了一定的理論支持。

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