大鼠三叉神經(jīng)痛模型中痛閾及膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的變化

秦泗佳 張曉紅 金海威 高璐 王福

1.西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系口腔解剖生理學(xué)教研室，西安 710021；2.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔基礎(chǔ)教研室，大連 116044

三叉神經(jīng)痛或稱痛性痙攣（抽搐），是指三叉神經(jīng)所支配的區(qū)域發(fā)生的強烈的陣發(fā)性疼痛。發(fā)病率約8/10萬[1]，多見于中老年人，平均發(fā)病年齡為（62.7±15.8）歲[2]，女性多于男性。隨著人口老齡化，其發(fā)病率亦有增高趨勢。盡管學(xué)者們已進行了大量的臨床和動物模型的研究，相繼提出了許多新的觀點和治療手段[3-4]，但其發(fā)病機制尚不清楚。因此，建立一種操作簡單且穩(wěn)定可靠的動物模型就顯得十分必要。在眾多的發(fā)病機制學(xué)說中有解剖學(xué)依據(jù)且被多數(shù)學(xué)者認可的是微血管壓迫學(xué)說，動物模型的建立多以此為基礎(chǔ)。本實驗通過結(jié)扎SD大鼠眶下神經(jīng)建立三叉神經(jīng)痛模型，觀察大鼠的行為反應(yīng)和疼痛閾值及膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）在不同時間點的變化，探討GDNF與疼痛的關(guān)系，對進一步探究三叉神經(jīng)痛的病因機制具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和分組

選擇健康成年清潔級SD大鼠36只，體重180 g±20 g。隨機選取6只作為空白對照組，手術(shù)組和假手術(shù)組各15只。手術(shù)組采用經(jīng)口內(nèi)右側(cè)眶下神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury to the infraorbital nerve，CCI-ION）法建立三叉神經(jīng)痛樣動物模型，假手術(shù)組只分離暴露右側(cè)的眶下神經(jīng)而不結(jié)扎，空白對照組不暴露也不結(jié)扎眶下神經(jīng)。

1.2 方法

1.2.1 建立模型 10%水合氯醛（0.004 mL·g-1）腹腔內(nèi)注射麻醉，取仰臥位，固定頭和四肢，將舌牽出并拉向一側(cè)，在大鼠口內(nèi)第一磨牙水平沿右側(cè)齦頰邊緣縱向切開約1 cm，逐層鈍性分離周圍組織，暴露眶下神經(jīng)，在眶下神經(jīng)近、遠心端分別用4-0鉻腸線疏松結(jié)扎，兩線之間的距離約為2 mm，結(jié)扎要松緊適度，要求在顯微鏡下見僅減少神經(jīng)的直徑，但仍然保持神經(jīng)表層血循環(huán)的通暢，且不阻斷神經(jīng)沖動傳導(dǎo)，4-0尼龍線縫合手術(shù)創(chuàng)口。假手術(shù)組除不結(jié)扎眶下神經(jīng)外，其余的操作均與手術(shù)組一樣?？瞻讓φ战M只進行麻醉、固定和消毒。所有手術(shù)操作都在無菌條件下展開，術(shù)前及術(shù)后未用抗生素。動物清醒后給予一般飼養(yǎng)。

1.2.2 痛閾測定 術(shù)前及術(shù)后1～12周每周觀察并記錄大鼠疼痛閾值及行為反應(yīng)。在大鼠適應(yīng)實驗環(huán)境后進行感覺測試。感覺測試器刺激的位置是眶下神經(jīng)在面部的支配區(qū)（觸須墊）。采用自制的大鼠固定籠固定大鼠，讓大鼠適應(yīng)一段時間，然后手持測試器緩慢接近大鼠，先在左側(cè)刺激3次，再刺激右側(cè)3次，兩次之間間隔10 s，測試過程中要使細絲彎曲；每一個強度共刺激6次，刺激過程中要保證測試器的強度由低到高依次增大。陽性反應(yīng)的表現(xiàn)為：1）不對稱性搔抓面部，至少連續(xù)3次搔抓刺激區(qū)。2）攻擊行為，表現(xiàn)為快速抓咬測試器。3）快速的后退、躲避動作，將身體倦縮靠向籠壁、頭面部藏于身下或?qū)㈩^轉(zhuǎn)向?qū)?cè)以避開刺激。出現(xiàn)上述的任意1項或多項即可判為陽性，當3次刺激中有2次或以上為陽性時，此時所對應(yīng)的細絲強度（克數(shù)）即為大鼠面部機械痛閾值，若此強度大于或等于26 g，將26 g作為該次測定的閾值。將手術(shù)側(cè)與對側(cè)和對照組結(jié)果進行比較和統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.3 取材及固定 分別于手術(shù)后1、2、4、6、12周隨機選取手術(shù)組和假手術(shù)組各3只大鼠處死，加上6只空白對照組大鼠共計36只，取三叉神經(jīng)節(jié)組織標本。具體操作為：10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后開胸，依次灌注0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛溶液，體式鏡下游離獲取雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)，4%多聚甲醛溶液固定24 h后，放入0.1 mol·L-1PBS，備用。

1.2.4 三叉神經(jīng)節(jié)標本GDNF免疫組織化學(xué)染色 將固定后的三叉神經(jīng)節(jié)標本經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。石蠟標本連續(xù)切片（厚5 μm），經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，冷卻至室溫后行免疫組織化學(xué)染色：1）0.01 mol·L-1PBS沖洗，3%H2O2去離子水室溫下孵育10 min；2）PBS沖洗，滴加50 μL山羊血清工作液，室溫下孵育10 min；3）加入一抗（GDNF抗體，稀釋度1︰200），搖勻后，4 ℃過夜；4）PBS沖洗，滴加50 μL生物素化二抗工作液，室溫下孵育10 min；5）PBS沖洗，滴加50 μL辣根酶標志鏈酶卵白素工作液，室溫下孵育10 min；6）PBS沖洗，滴加50 μL新配制的DAB顯色劑顯色；7）自來水充分沖洗后，蘇木素染液復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察GDNF在三叉神經(jīng)節(jié)中的表達和分布情況并拍照。在手術(shù)組及假手術(shù)組每只大鼠標本的切片中按先后次序隔10張選取1張，共選10張，每張切片在400倍鏡下分別隨機選取10個視野拍照，將所得的照片導(dǎo)入到Image-Pro Plus 6.0軟件中，然后進行石蠟組織切片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的半定量分析，計算出每個視野的累積光密度值（integrated optical density，IOD）與面積（S），然后用總的累積光密度值除以總面積，就可以得出每張切片的平均光密度值（optical density，OD）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件的重復(fù)測量資料的方差分析和t檢驗對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料的實驗數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標準差表示，以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的疼痛閾值及行為反應(yīng)變化

2.1.1 手術(shù)組 術(shù)前術(shù)后不同時間大鼠的痛覺反應(yīng)閾值見圖1。由圖1可見，術(shù)后1周刺激大鼠右側(cè)眶下神經(jīng)在面部的感覺支配區(qū)域后，出現(xiàn)低反應(yīng)期，疼痛閾值明顯增高，大鼠反應(yīng)遲鈍。術(shù)后2周，閾值急劇下降為0.75 g±0.04 g，大鼠易激惹，表現(xiàn)為受極低強度的刺激，即可出現(xiàn)上述陽性反應(yīng)，持續(xù)至術(shù)后6周，然后閾值緩慢增高，在術(shù)后10～12周恢復(fù)到手術(shù)前的水平。左側(cè)疼痛閾值變化趨勢與手術(shù)側(cè)相似，術(shù)后1周亦出現(xiàn)短暫的高閾值反應(yīng)遲鈍期，但不如右側(cè)明顯。術(shù)后2周閾值最低，為1.00 g±0.05 g，低閾值持續(xù)至第5周，然后緩慢升高至正常水平。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)t檢驗分析表明：在術(shù)前、術(shù)后1周和10～12周，左右兩側(cè)疼痛閾值相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在術(shù)后2～9周，左右兩側(cè)疼痛閾值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 手術(shù)組和假手術(shù)組術(shù)前術(shù)后不同時間大鼠的痛覺反應(yīng)閾值Fig 1 The pain threshold of rats in operative and sham-operative group at different time before and after operation

2.1.2 空白對照組與假手術(shù)組 術(shù)前及術(shù)后各時間點刺激空白對照組和假手術(shù)組大鼠左、右側(cè)眶下神經(jīng)在面部的感覺支配區(qū)域后大鼠反應(yīng)正常，兩組大鼠兩側(cè)疼痛閾值無明顯變化（圖1）。經(jīng)統(tǒng)計分析，同組及兩組大鼠之間各時間點左右兩側(cè)疼痛閾值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組大鼠右側(cè)疼痛閾值變化比較

術(shù)后1周手術(shù)組右側(cè)疼痛閾值明顯高于另兩組，而術(shù)后2～9周疼痛閾值明顯低于另兩組。術(shù)后1～9周手術(shù)組右側(cè)的疼痛閾值與另兩組右側(cè)的疼痛閾值相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)前及術(shù)后10～12周，手術(shù)組右側(cè)與假手術(shù)組、空白對照組右側(cè)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中GDNF的表達變化和分布情況

各組三叉神經(jīng)節(jié)組織切片經(jīng)GDNF免疫組織化學(xué)染色，均可見免疫陽性細胞，該陽性細胞多數(shù)呈橢圓形、圓形和多角形，手術(shù)組三叉神經(jīng)節(jié)中陽性細胞數(shù)要多于空白對照組。免疫陽性物質(zhì)大多呈現(xiàn)棕黃色，主要分布在細胞質(zhì)及細胞核中，細胞核著色較深，但核仁沒有陽性著色（圖2）。手術(shù)組大鼠術(shù)后三叉神經(jīng)節(jié)中GDNF的表達量增高，且表達量隨著時間的推移而改變。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析表明：與術(shù)前及假手術(shù)組相比，術(shù)后1、2、4周手術(shù)組GDNF的OD值明顯升高（P＜0.01），術(shù)后6周恢復(fù)至術(shù)前水平（P＞0.05）。假手術(shù)組和空白對照組術(shù)前術(shù)后的OD值相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖2 手術(shù)組GDNF在大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中的表達 免疫組織化學(xué)染色× 400Fig 2 The expression of GDNF in operative group trigeminal ganglia immunohistochemistry× 400

圖3 術(shù)前術(shù)后大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中GDNF的變化Fig 3 The changes of GDNF in trigeminal ganglia before and after surgery

3 討論

3.1 建立CCI-ION動物模型的理論基礎(chǔ)

目前三叉神經(jīng)痛的臨床治療方法有很多種，但臨床效果并非理想，究其原因是對三叉神經(jīng)痛的發(fā)病原因和機制尚不明確。目前提出的有關(guān)三叉神經(jīng)痛發(fā)病機制的學(xué)說主要可分為中樞病因?qū)W說和周圍病因?qū)W說兩大類。中樞學(xué)說認為是大腦皮質(zhì)與丘腦過多的神經(jīng)電活動導(dǎo)致的癲癇樣發(fā)作或三叉神經(jīng)脊束核與感覺核控制異常痛覺傳入信號的能力下降而產(chǎn)生疼痛。主要的解釋是閘門學(xué)說。周圍學(xué)說則認為三叉神經(jīng)根、節(jié)受到壓迫導(dǎo)致的三叉神經(jīng)脫髓鞘是三叉神經(jīng)痛的主要病因和病理改變，其后眾多學(xué)者都證實了這一觀點。目前提出的主要解釋有串擾學(xué)說和點燃學(xué)說。造成神經(jīng)壓迫的原因可以歸結(jié)為血管壓迫和硬膜鞘、帶和骨性壓迫。此后眾多的學(xué)者先后建立了許多相關(guān)的動物模型：慢性縮窄環(huán)模型[5-6]、三叉神經(jīng)末梢致痛模型[7]、三叉神經(jīng)根埋植模型[8]、牙髓灌注模型[9]、經(jīng)顳下窩暴露三叉神經(jīng)節(jié)模型[10]、經(jīng)枕骨下暴露三叉神經(jīng)根和顳下暴露三叉神經(jīng)節(jié)模型[11]。

本次實驗建立和采用的眶下神經(jīng)慢性壓迫性縮窄環(huán)模型就是模擬了血管壓迫學(xué)說，對神經(jīng)造成壓迫，觀察術(shù)前術(shù)后大鼠的行為反應(yīng)、疼痛閾值和神經(jīng)微循環(huán)的變化。結(jié)果顯示：術(shù)后1周出現(xiàn)一個短暫的遲鈍反應(yīng)期，估計可能的原因是結(jié)扎后阻礙了神經(jīng)信號傳入通路的通暢。術(shù)后2周大鼠處于超敏反應(yīng)期，對較低的非疼痛性刺激即可產(chǎn)生疼痛反應(yīng)和自發(fā)性疼痛。對于手術(shù)組左側(cè)在術(shù)后2周也出現(xiàn)了三叉神經(jīng)痛樣反應(yīng)的機制目前尚不十分清楚，有的學(xué)者[12]認為是由于“交叉興奮”的原因而引起的疼痛反應(yīng)，也有的學(xué)者[13]認為與三叉神經(jīng)中樞核團中的P物質(zhì)和酸性磷酸酶的活性增強有關(guān)系，還有的學(xué)者[14]認為是慢性壓迫所導(dǎo)致的神經(jīng)干的病變引起了高位神經(jīng)中樞的病變，也有可能是動物模型的條件反射，到底是什么機制還有待于進一步研究。該方法能夠有效地模擬臨床上的三叉神經(jīng)痛，具有操作簡單、重復(fù)性好、貼近臨床和成功率高等優(yōu)點。通過該模型的建立可更進一步深入探究三叉神經(jīng)痛的病因機制和采用不同方式的治療觀察其療效。

3.2 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中GDNF的表達與三叉神經(jīng)痛

GDNF屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族，是靶源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠促進神經(jīng)元的生長發(fā)育、存活及再生，還能夠延長軸索的長度，使其朝靶器官的方向生長，還能保護離斷軸突的感覺及運動神經(jīng)元，阻止其退化和凋亡[15]。人的GDNF分子與鼠的GDNF有93%～95%同源性，在人和鼠的尾狀核中有高表達，而殼核中則是低表達。GDNF還表達在感覺神經(jīng)元（如三叉神經(jīng)節(jié)）和自主神經(jīng)元（如副交感節(jié)）所支配的組織中，并對這些神經(jīng)元起著營養(yǎng)的作用[16]。

國內(nèi)已有學(xué)者對GDNF的鎮(zhèn)痛作用展開研究，主要的研究集中在腦、脊髓和坐骨神經(jīng)損傷或結(jié)扎后GDNF的表達變化規(guī)律。吳旭等[17]通過研究腦損傷后GDNF的變化發(fā)現(xiàn)，其表達量具有一定的時間規(guī)律性，可以用來推斷腦損傷的時間。羅偉等[18]則研究了脊髓半橫斷損傷后GDNF的表達變化，發(fā)現(xiàn)損傷后其表達明顯增多，認為在其損傷的早期發(fā)揮修復(fù)作用。另有學(xué)者[19]通過各種途徑增加外源性GDNF，研究其對坐骨神經(jīng)損傷后病理變化的影響，結(jié)果都說明GDNF的增多能夠保護受損的神經(jīng)元，并能增加機械刺激疼痛閾值，參與神經(jīng)痛的調(diào)控。最新的研究方向是通過構(gòu)建GDNF基因載體，導(dǎo)入神經(jīng)內(nèi)使其穩(wěn)定長效的表達。有學(xué)者[20-21]已通過構(gòu)建慢病毒載體來轉(zhuǎn)染T細胞與神經(jīng)干細胞，并取得了很好的結(jié)果，但尚未見將其作為一種臨床治療方法的報道。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法，表明了在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)有GDNF免疫陽性物質(zhì)且大多呈現(xiàn)棕黃色，分布在細胞質(zhì)及細胞核中，細胞核著色較深，但核仁沒有陽性著色。手術(shù)組在術(shù)后1周表達量開始增多，一直持續(xù)到術(shù)后4周，此期間GDNF的表達量與假手術(shù)組相比有顯著差異，說明手術(shù)造成神經(jīng)軸突的損傷累及神經(jīng)元細胞體導(dǎo)致其凋亡，從而刺激了膠質(zhì)細胞和雪旺細胞GDNF的分泌，通過遠端運輸和旁分泌等途徑進入胞體，減少神經(jīng)元細胞的凋亡，促進神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的修復(fù)再生和減少神經(jīng)元的異常放電。這些都說明GDNF在調(diào)控口腔頜面部痛、溫覺沖動的傳入和三叉神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生中有一定作用。

建立穩(wěn)定可靠的動物模型有利于相關(guān)實驗的后續(xù)研究，慢性壓迫大鼠眶下神經(jīng)導(dǎo)致神經(jīng)微循環(huán)的改變，進而引起神經(jīng)纖維變性和脫髓鞘，使大鼠表現(xiàn)為痛覺超敏，輕微的刺激即可產(chǎn)生異常的電信號引發(fā)疼痛，GDNF通過提高神經(jīng)營養(yǎng)，阻止細胞凋亡，促進軸索再生延長來修復(fù)受損神經(jīng)，重建正常的神經(jīng)通路，減弱和消除異常神經(jīng)電信號的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，從而達到鎮(zhèn)痛的目的。

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