局部應用脂聯素基因重組腺病毒對骨缺損修復的影響

呂雪 柳娜 杜文 李佳洋 孫玥 羅恩

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院正頜與關節外科（四川大學），成都 610041

骨缺損一般由創傷、感染、腫瘤切除或先天性疾病等造成，治療方法包括骨移植、組織工程技術、膜引導性組織再生技術、基因療法、生長因子療法等。盡管骨缺損的修復已經取得很大的成就，但仍面臨許多問題，其治療方法也存在著不同的局限性。安全高效的骨缺損修復方法是目前研究的熱點。

脂聯素（adiponectin，APN）也被稱為脂肪細胞補體相關蛋白，抵抗素1和脂肪基因，是一種主要由脂肪組織合成和分泌的脂肪因子[1]。在不同的組織中，APN發揮著不同的作用，它與胰島素敏感度的調節、能量平衡、動脈粥樣硬化以及炎癥反應密切相關。近年來，越來越多的研究發現APN與骨代謝密切相關。Lenchik等[2]發現，血清APN的濃度與骨密度呈負相關。也有學者[3-5]發現，在人類的股骨及脛骨成骨細胞表面，小鼠成骨細胞及破骨細胞表面，MG-63細胞株及成骨細胞株表面均有APN及其受體表達。采用不同方式將APN應用于牽張成骨和種植體周圍成骨，在體內實驗中證實APN有促進成骨的作用。本實驗構建了SD大鼠脛骨骨缺損模型，采用腺病毒載體攜帶外源基因人APN（human APN，hAPN），并將重組的腺病毒載體Ad-hAPNΕGFP局部注射于骨缺損處，探討hAPN對SD大鼠骨缺損修復的影響。

1 材料和方法

1.1 hAPN重組腺病毒表達載體的構建

含有重組hAPN目的基因的質粒由美國Tufs大學牙醫學院Jake Chen教授提供。padTrack-CMV重組穿梭載體和pAdeasy-1重組腺病毒骨架載體由漢恒生物（上海）實驗室提供。重組腺病毒Ad-hAPN-ΕGFP的構建與鑒定采用張志明等[6]的方法，構建成功后Ad-hAPN-ΕGFP病毒滴度（plaque forming unit，PFU）為每毫升1×1011個。

1.2 動物模型建立

取36只250～280 g的SD大鼠（四川大學華西醫學實驗動物中心），雌雄不限。于雙側膝關節內側區縱向切開皮膚、皮下組織和骨膜，顯露脛骨前端，在脛骨內側面距離生長板約1 mm處，用臺式慢速牙科電鉆低速鉆孔制備一直徑約2 mm的圓形骨缺損（生理鹽水沖洗降溫），深達骨髓腔，不穿通對側骨密質。術后分層拉攏縫合傷口，0.5%聚維酮碘消毒術區。

36只大鼠72側脛骨缺損隨機分成A、B、C共3組，每組24側。A組為Ad-hAPN-ΕGFP組：取10 μL Ad-hAPN-ΕGFP病毒液用0.5 mL生理鹽水稀釋，用醫用12號注射針分別取0.25 mL稀釋病毒液于術中注入雙側骨缺損區，術后第2天從正常皮膚處進入，潛行于骨缺損處，再次緩慢注射相同滴度的稀釋病毒液。B組為空白腺病毒組：以不含hAPN重組基因的空白腺病毒Ad-ΕGFP作對照，術中及術后第2天采用相同方法注入相同滴度相同劑量不含hAPN重組基因的病毒液。C組為空白對照組：術中及術后第2天采用相同方法注入同等劑量的生理鹽水。3組大鼠術后立即肌肉注射青霉素抗感染，劑量為每次4.0×105U，每日2次，連續注射3 d；術后采用常規顆粒飼料飼養。術后第3周取材進行檢測。

1.3 骨缺損修復觀察指標

術后1周于各組大鼠中隨機取4只，用過量麻醉注射處死，獲取骨缺損區標本，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）。術后3周處死剩余大鼠，各組中剩余8只大鼠隨機取4只用顯微CT掃描骨缺損區，另外4只用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HΕ）染色及Masson染色以觀察組織學變化。

1.3.1 real-time PCR 無菌無酶條件下快速取出骨缺損區標本，修整大小，剔除軟組織，生理鹽水沖洗干凈后，放入凍存管中，于液氮罐中保存待用。實驗時取出標本，置于研缽中，骨鉗夾碎，加入少量液氮，迅速研磨至骨塊成粉末狀，加入Trizol（寶生物工程大連有限公司）提取總RNA，按照試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明進行反轉錄及real-time PCR，檢測hAPN和成骨相關因子骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor-2，Runx2）的相對表達量。hAPN和3種成骨相關因子的引物序列見表1，引物由美國Life Technologies Corporation-Thermo Fisher公司合成。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3.2 顯微CT 修整標本大小，固定于4%多聚甲醛液（Sigma公司，美國）中，用μ-CT40型顯微CT機（Scanco公司，瑞士）對標本進行掃描，工作電壓70 kV，工作電流114 μA，整合時間700 ms，然后用隨機軟件在配套工作站上行顯微CT數據三維重建并定量分析標本興趣區（region of interest，ROI）內新生骨量（與上述ROI范圍一致）。測定的新生骨參數包括骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數（relative bone volume，BV/TV）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

1.3.3 HΕ及Masson染色 標本于4%多聚甲醛液中固定48 h后，沖洗標本，用10%乙二胺四乙酸脫鈣液脫鈣60 d，70%～100%乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續切片，厚度為5 μm，作HΕ及Masson染色。染色后光鏡下觀察切片，采集圖像。對HΕ切片進行定量分析，3組中隨機取標本中心切面完整的4張組織學HΕ染色切片，在顯微鏡下取40倍視野，每張切片觀測5個視野，按新骨形成面積與視野總面積比值來比較各組間是否存在差異。

1.4 統計方法

采用SPSS 12.0軟件包對數據進行t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 real-time PCR檢測結果

real-time PCR檢測顯示：A組hAPN的表達較高，證明Ad-hAPN-ΕGFP轉染成功；而B、C組的PCR循環數Ct值均大于30，表示B、C兩組無hAPN的表達。成骨相關因子OCN、BMP-2及Runx2在3組中的相對表達量見圖1：3種成骨相關因子在3組大鼠中均有表達，A組的表達量明顯大于B、C兩組，差異有統計學意義（P＜0.05），而B、C組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 A、B、C組成骨相關因子OCN、BMP-2及Runx2的相對表達量Fig 1 Osteogenesis related factors(OCN,BMP-2,and Runx2)expression of group A,B,and C

2.2 顯微CT測試結果

對術后3周標本的顯微CT掃描數據進行三維重建，結果見圖2：3組的骨缺損部位均沒有形成完全的骨愈合，都存在無新骨形成的空白區域；但與B、C組相比，A組骨小梁相對致密，空白區域較少。通過選取ROI檢測各組的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th，結果見表2：A組各項參數均明顯高于B、C組（P＜0.05），而B、C組之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。該結果提示A組成骨較B、C組明顯，成骨量更高。

圖2 骨缺損區顯微CT三維重建圖像Fig 2 Three-dimensional micro-CT images of the bone defect area

2.3 HΕ及Masson染色結果

3組大鼠術后3周骨缺損區的HΕ和Masson染色結果見圖3，通過光學顯微鏡觀察可見各組的新骨形成情況。術后3周，各組骨缺損內均充滿新生骨小梁。與B、C組相比，A組骨小梁數量較多，寬度較大，排列更為緊密。HΕ染色切片的定量分析結果顯示：A組骨缺損內新骨形成面積與視野總面積比值（47.12%）大于B組（24.68%）和C組（21.95%），差異有統計學意義（P＜0.05），而B、C組新骨形成面積與視野總面積的比值相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 ROI內顯微CT參數分析結果Tab 2 Micro-CT parameters of the ROI

圖3 骨缺損區的組織學染色× 100Fig 3 Histological staining of the bone defect area× 100

3 討論

本研究構建了SD大鼠脛骨骨缺損的體內實驗模型，將重組腺病毒Ad-hAPN-ΕGFP直接注入骨缺損區內，術后1周real-time PCR結果顯示，APN轉染組的hAPN表達量較高，而空白腺病毒轉染組及空白對照組無hAPN表達。術后3周的檢測結果證明了局部應用重組腺病毒Ad-hAPN-ΕGFP可以促進骨缺損的修復。

目前關于APN對成脂成骨的作用尚無定論。Shinoda等[4]認為，通過自分泌或旁分泌產生的APN可以促進骨形成，而通過內分泌途徑產生的APN則抑制骨形成，另外，APN還可以通過影響胰島素通路間接地促進成骨。Luo等[7]發現，APN通過APN受體/c-Jun氨基末端激酶途徑促進人類成骨細胞增殖，通過APN受體/p38絲裂原活化蛋白激酶途徑促進成骨細胞分化。在成骨細胞、破骨細胞及單核細胞共培養體系中，APN通過APN受體/p38絲裂原活化蛋白激酶途徑誘導人類成骨細胞核因子κB受體活化因子配體生成，抑制骨保護蛋白的表達，從而誘導破骨細胞分化[8]。在體內實驗中，學者們構建了不同的動物模型來研究APN在體內環境中對成骨的影響。目前大部分的體內實驗證實APN可以促進成骨，但其機制尚不清楚；推測APN主要是通過抑制破骨細胞的分化及骨吸收功能，同時刺激血管生成而促進成骨，還可能通過直接促進成骨細胞分化而促進成骨。Oshima等[9]將重組APN注入小鼠頸靜脈，發現重組APN可以抑制破骨細胞分化，促進細胞堿性磷酸酶mRNA的表達和骨基質的礦化。本課題組在前期研究中[10]證實，緩釋APN可促進卵巢摘除大鼠羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）周圍的骨再生，并可抑制破骨細胞的功能。有學者[11-12]采用新西蘭白兔構建了牽張成骨模型，將重組的hAPN注入牽張間隙，結果發現，間斷性使用重組hAPN可以促進快速牽張中的骨再生。

關于APN在種植體及植入材料周圍成骨，牽張成骨及激素性股骨頭壞死模型中的作用已有較多報道，但采用基因治療促進骨缺損修復的研究還較少。隨著基因治療的普及，腺病毒載體受到廣泛關注。該載體生產工藝簡便，制備純化相對容易，病毒滴度高，外源基因容量大，并且無插入突變激活癌基因的危險；因此，采用重組腺病毒載體治療骨缺損具有良好的應用前景。本實驗構建了SD大鼠脛骨骨缺損模型，將Ad-hAPN-ΕGFP稀釋病毒液直接注入骨缺損，術后通過real-time PCR、顯微CT、HΕ及Masson染色檢測成骨效果。術后1周real-time PCR結果顯示hAPN轉染組成骨相關因子（OCN、BMP-2、Runx2）基因的相對表達量明顯大于空白腺病毒組及空白對照組。術后3周，顯微CT及HΕ、Masson染色顯示：與空白腺病毒組及空白對照組相比，轉染腺病毒組骨缺損中心新生骨質明顯增多，骨質相對成熟，板層骨所占比例也較大。本研究成功證明了局部應用重組Ad-hAPN-ΕGFP可以促進SD大鼠脛骨骨缺損的修復。

hAPN與大鼠APN具有高度同源性，過表達的hAPN對破骨細胞的抑制及對成骨細胞的激活可能是產生這一結果的原因；但是，體內環境復雜多變，hAPN在骨缺損模型中是如何抑制破骨細胞、激活成骨細胞的呢？除了影響成骨及破骨平衡以外，hAPN是否同樣可以通過影響成骨和成脂平衡從而促進成骨？既然APN主要是由脂肪細胞合成及分泌，那過表達的hAPN對脂肪細胞及骨髓基質細胞的成脂分化作用如何？這些問題尚需進一步研究。

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