慢性間歇低氧對大鼠牙周炎模型血清及牙齦組織中白細胞介素-18和低氧誘導因子-1α的影響

王斌 王小琴

山西醫科大學第一醫院口腔科，太原 030001

牙周炎是影響口腔健康的重要疾病，其致病機制除了細菌的直接侵入，細菌毒素及代謝產物也可破壞牙周組織，引起炎癥反應和免疫反應，產生一系列炎癥介質。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是表現為睡眠時嚴重打鼾，呼吸暫停或憋氣并會引起各重要器官、系統功能改變的一種疾病。目前已經發現，牙周炎和OSAHS有密切關系[1-2]。牙周炎患者中白細胞介素（interleukin，IL）-18和低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α的表達明顯升高[3-4]；而OSAHS患者血清中IL-18水平也明顯高于正常人群，且隨著疾病嚴重程度的增加而增加[5]。有實驗[6]發現，慢性間歇低氧誘發了HIF-1α表達升高，而慢性間歇低氧是OSAHS的一個顯著特征，由此推斷，IL-18、HIF-1α與牙周炎和OSAHS可能存在某種聯系。目前關于牙周炎和OSAHS的研究還較少，本研究通過建立模擬OSAHS的間歇低氧條件下的大鼠牙周炎模型，觀察IL-18和HIF-1α在血清和牙齦組織中的表達，探討牙周炎和OSAHS發病相關的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗材料和儀器 水合氯醛，大鼠IL-18酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠HIF-1α ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。動物間歇低氧倉（山西醫科大學第一醫院），測氧儀（浙江電化分析儀器廠）；醫用氧氣（太原市欣易得氣體廠）和高純度氮氣（北方氣體有限公司）。

1.1.2 實驗動物 5周齡健康雄性SD大鼠32只，質量（200±20） g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及建模 將32只大鼠適應性喂養1周，節律性光照，用隨機數字表法將其分為4組：常氧對照組（A組）、常氧牙周炎組（B組）、低氧對照組（C組）、低氧牙周炎組（D組），每組8只，分籠飼養。A組：普通飼料喂養。B組和D組：10%的水合氯醛腹腔麻醉后，用0.2 mm的結扎絲結扎于大鼠雙側上頜第二磨牙牙頸部，盡量置于齦溝內，每周檢查一次結扎絲，如有脫落應再行結扎；1周內逐漸增加高糖食物比例直至完全代替普通飼料，每日用高糖粉質飼料喂養。C組和D組：參考杜曉燕等[7]的方法，將大鼠放入間歇低氧艙內，每天缺氧時間為8 h。在實驗期間，氮氣和氧氣在電磁閥的控制下循環輸入低氧艙，每個循環為90 s，通過測氧儀監測低氧艙內的氧體積分數，最低為9%，最高為21%。低氧艙的低氧程度相當于臨床上OSAHS患者中、重度水平。實驗共歷時8周。

1.2.2 牙周臨床指數檢查 8周后，所有大鼠禁食12 h以上，麻醉后先拆除其結扎絲，用牙周探針測量各組大鼠雙側上頜第二磨牙的出血指數（bleeding index，BI）及牙周附著喪失（attachment loss，AL）并作記錄。BI的測定采用Mazza（1981）計分標準，AL為釉牙骨質界至牙周袋底的距離。先用牙周探針測量牙周袋深度，當探針退出時測得釉牙骨質界到齦緣的距離，兩者相減為AL。每顆牙測量頰側近中、頰側中央、頰側遠中3個位點，兩側牙共測量6個位點，取均值。上述所有操作均由同一醫師進行。

1.2.3 影像學檢查和組織切片制作 實驗結束后，用斷頭法處死實驗動物，解剖取出上頜骨磨牙段。將上頜骨在多聚甲醛溶液中固定48 h，運用牙科X線機對取出的上頜骨進行影像學檢查，觀察牙槽骨吸收情況；然后用脫鈣液脫鈣2周，經脫水、包埋后制作切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.2.4 牙齦組織及血清中IL-18、HIF-1α的檢測 大鼠空腹下，腹主動脈取血，3 000 r·min-14 ℃下離心15 min，取上清液，裝入EP管中，標號，-70 ℃保存。牙齦組織樣本取自第二磨牙周圍牙齦組織，用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，制備組織勻漿（牙齦組織與鹽水體積比為1∶9）3 000 r·min-14 ℃下離心15 min，取上清液，標號，-70 ℃保存。血清復溫至室溫，牙齦組織上清液用生理鹽水稀釋為1%的勻漿樣本（體積比1∶9），分別使用IL-18、HIF-1α ELISA試劑盒對其進行檢測。以OD值為橫坐標，IL-18、HIF-1α的標準品濃度為縱坐標，得到曲線方程：IL-18為Y=27.066x2+331.50x-10.997（R2=0.999 5），HIF-1α為Y=16.596x2+96.513x-2.257 7（R2=0.999 7）；通過曲線獲得各樣本的質量濃度。

1.2.5 數據分析方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。各組BI總體比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗，定量資料AL及ELISA結果組間比較采用方差分析，D組血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α質量濃度與AL的相關性采用Spearman相關分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 牙周臨床指數檢查

各組大鼠的BI檢測結果見表1：A組與B組之間，C組與D組之間的差異均有統計學意義（P<0.05）；而B組與D組之間，A組與C組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。D組AL與其余3組之間的差異有統計學意義，B、C組AL值與A組之間的差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

表1 4組大鼠的BI和AL測量結果Tab 1 The results of BI and AL in four groups of rats n=8

2.2 影像學觀察

4組大鼠的X線檢查結果見圖1：A組牙槽骨無明顯吸收（圖1A）；B組有一定程度的牙槽骨吸收，牙周膜間隙明顯增寬（圖1B箭頭示）；C組牙槽骨有一定的骨質吸收（圖1C箭頭示）；D組結扎區牙槽骨有較明顯的骨質吸收，部分根分叉暴露（圖1D箭頭示）。

2.3 組織學觀察

4組大鼠牙周組織HE染色結果如圖2所示：A、C組根分叉區牙槽骨基本正常，B、D組根分叉區可見牙槽骨的骨吸收陷窩增加，牙周纖維紊亂、破壞，牙周組織破壞嚴重。

2.4 IL-18、HIF-1α質量濃度的測定

4組大鼠IL-18、HIF-1α的質量濃度見表2：B、C組的IL-18、HIF-1α質量濃度明顯高于A組（P<0.05），D組高于其他3組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

圖1 4組大鼠牙槽骨的X線片Fig 1 X-ray images of alveolar bone in four groups of rats

圖2 4組大鼠上頜第二磨牙根分叉區組織學觀察 HE × 40Fig 2 Histological observation of the furcation of maxillary second molars in four groups of rats HE × 40

表2 4組大鼠血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α的表達Tab 2 Expression of IL-18 and HIF-1α in serum and gingival tissues in four groups of rats pg·mL-1, n=8,x±s

2.5 D組血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α質量濃度與AL的相關性

經Spearman相關性檢驗，D組血清中IL-18、HIF-1α質量濃度與AL呈正相關，相關系數r分別為0.792和0.753（P<0.05），D組牙齦組織中IL-18、HIF-1α質量濃度與AL也呈正相關，相關系數r分別為0.817和0.779（P<0.05）。

3 討論

牙周炎是一種涉及到免疫炎癥反應的疾病，而OSAHS也是與炎癥相關的疾病。Ahmad等[8]發現：中重度牙周炎和OSAHS的發生有密切關系。間歇性低氧是OSAHS的一個顯著特征。Ryan等[9]認為，OSAHS的間歇低氧/復氧可能是引起炎癥反應的主要因素，引起炎癥的主要有兩條通路：1）依賴核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）產生炎癥介質，從而形成炎癥反應通路；2）依賴HIF-1產生的適應性通路。Burioka等[10]也認為：間歇性低氧能通過激活NF-κB信號通路，產生炎癥細胞因子。基于此，本實驗通過測定炎癥因子IL-18和HIF-1α來研究牙周炎和OSAHS發病相關的可能機制。

IL-18是重要的促炎細胞因子，與多種疾病關系密切。牙周炎患者的齦溝液及血清中IL-18水平均要明顯高于正常組[3,11]。有學者[12]對IL-18與牙周炎發生進行Meta分析，發現二者存在相關性，可作為預測牙周炎發展過程的一個生物學指標。但是，目前仍然無充足的證據來解釋IL-18在牙周炎發生發展中所起的作用。Yoshinaka等[13]認為，IL-18是通過CD4+T細胞產生核轉錄因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL）引起牙槽骨喪失，從而導致牙周炎發生。

HIF-1是一種氧調控轉錄因子，在哺乳動物的生理疾病的發病機制中發揮重要作用[14]。HIF-1由α和β兩個亞單位構成，與多種疾病密切相關[15-16]。在組織低氧的情況下，可以誘導HIF-1α蛋白水平增加。Ng等[17]認為，由于炎癥牙周組織的血管微循環受阻，白細胞浸潤增加，牙周組織氧含量失調，產生的一些炎癥介質如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可以激活HIF-1通路，導致牙周組織中HIF-1α表達增加。有學者[18]通過氯化鈷模擬低氧實驗發現，低氧通過激活HIF-1α促進牙周成纖維細胞的凋亡。這些實驗均提示HIF-1α在牙周炎發展中起重要作用。

本實驗成功建立了慢性間歇低氧牙周炎大鼠模型，可以觀察到間歇低氧牙周炎組大鼠牙齦組織糜爛，影像學和組織學觀察顯示牙周組織破壞在4組中最為嚴重。BI結果顯示，低氧對照組與常氧對照組、低氧牙周炎組與常氧牙周炎組的差異均無統計學意義，考慮可能是樣本量較小的緣故。此外，低氧對照組與常氧對照組相比，低氧牙周炎組與常氧牙周炎組相比，AL的差異均有統計學意義，說明間歇低氧能促進牙周附著喪失，加重牙周炎癥。同時，低氧對照組血清及牙齦組織中IL-18、HIF-1α質量濃度較常氧對照組，低氧牙周炎組較常氧牙周炎組均有顯著升高（P<0.05），與蘇曉麗等[6]的部分研究結果一致。此外，低氧牙周炎組IL-18、HIF-1α的質量濃度和AL存在正相關（P<0.05）。這些結果均說明慢性間歇低氧能促進牙槽骨的附著喪失，加重牙周炎癥，并且與IL-18、HIF-1α的表達有關。慢性間歇低氧誘導IL-18、HIF-1α表達的增加，可能是OSAHS加重牙周炎的機制之一。目前，關于慢性間歇低氧誘導IL-18的機制仍不清楚。Li等[5]認為可能的機制是：1）許多細胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6誘導IL-18的表達；2）重復的夜間血氧不足和氧化應激反應直接誘導IL-18表達。有研究[19]表明，慢性間歇低氧可能通過激活NF-κB炎癥通路，使TNF-α、IL-8等炎癥細胞因子的濃度升高。由此推斷，慢性間歇低氧可能通過激活NF-κB炎癥通路，進而誘導IL-18表達的增加，從而加重牙周炎癥。

本文探討了慢性間歇低氧條件下大鼠血清及牙齦中IL-18、HIF-1α質量濃度的變化，為研究OSAHS患者牙周炎的發病機制提供了相關依據，但OSAHS和牙周炎都是多因素作用的炎癥性疾病，其具體機制有待進一步研究。

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