4-硝基喹啉-1-氧化物誘導C57BL/6小鼠舌黏膜癌變的研究

代曉明 劉華 左志斌 秦少華 阮永華 李逸松

1.昆明醫科大學第一附屬醫院整形外科頜面組，昆明 650032；2.云南省第二人民醫院口腔頜面外科，昆明 650021；3.昆明醫科大學基礎醫學院病理教研室，昆明 650500

口腔鱗狀細胞癌（以下簡稱口腔癌）是人類最常見的惡性腫瘤之一，在我國舌癌居口腔癌的首位[1-4]。缺乏早期特異性診斷標志物以及有效的治療靶點是舌癌患者臨床治療效果不佳的主要原因[5]。獲得理想的舌癌動物模型是解決上述問題的關鍵。二甲基苯并蒽（9,10-Dimethyl-benzanthrancene，DMBA）誘導金黃地鼠（Syrian hamster）口腔癌模型在20世紀50年代已有報道[6]。4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline 1-oxide，4NQO）誘導大鼠黏膜癌變被認為是更加理想的口腔癌動物模型[7]。本課題組擬對4NQO誘導C57BL/6小鼠舌黏膜癌變的規律和特點進行研究，為后續舌癌的發病機制研究及找尋新防治靶點提供可靠的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

85只雌性C57BL/6小鼠，SPF級，體質量為18～20 g，鼠齡30～50 d，購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.2 實驗試劑及設備

4NQO（Sigma公司，美國），用1,2丙二醇配置成500 mg·L-1，避光保存于4 ℃冰箱備用。1,2丙二醇分析純（西隴化工股份有限公司），光學顯微鏡（Nikon公司，日本），生物組織脫水機（TS-12J型，孝感市宏業醫用儀器有限公司），生物組織包埋機（BM-VI型，孝感電子儀器廠），組織切片機（Leica2235型，Leica公司，德國），圖片采集系統（BX-51型顯微鏡，奧林巴斯公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將85只C57BL/6小鼠分為3組：蒸餾水對照組（n=5），1,2丙二醇對照組（n=5），實驗組（n=75）。75只實驗組小鼠再隨機分為15籠，每籠5只，并對每籠進行標記，即第0周對應第1籠，第2周對應第2籠，第4周對應第3籠，以此類推，第28周對應第15籠。實驗開始時（第0周，W=0）處死實驗組第1籠小鼠，之后每2周處死1籠實驗組小鼠，直至28周。其余2個對照組小鼠于28周處死。處死小鼠前，對小鼠以部位（頭、臂、背、腰、尾）進行標記。

1.3.2 給藥方式 1）實驗組：用蒸餾水稀釋1,2丙二醇配置的4NQO至終濃度為50 mg·L-1，置于避光瓶內作為飲用水供自由飲用至16周，16周后換為蒸餾水繼續喂養，至28周實驗結束。2）1,2丙二醇對照組：按照與4NQO組含有相同濃度的1,2丙二醇水溶液喂養至16周，16周后換為蒸餾水繼續喂養，直至28周實驗結束。3）蒸餾水對照組：將蒸餾水置于透明塑料瓶中自由飲用。

1.3.3 實驗觀察 1）大體觀察：每3 d觀察小鼠精神狀態、毛發、飲食、飲水及排便情況。每2周稱取體質量，直至處死。處死后觀察小鼠口腔黏膜變化情況、拍攝照片。2）組織病理學：使用斷頭法處死實驗組小鼠，小鼠被處死后將新鮮舌組織切下，測量、觀察標本的大體病變情況，并將舌由中線處縱向均等切為兩半，一份放置于10%甲醛溶液中保存，另一份迅速放入液氮速凍，再轉移至-80 ℃冰箱保存，以作后續分析。待所有小鼠處死后，從0、4、8、12、16、20、24、28周實驗組及蒸餾水對照組、1,2丙二醇對照組小鼠舌組織中，各隨機選取3個制作石蠟切片。組織常規包埋，連續切片（切成4 μm蠟帶）直至剩余組織不能再切為止，選擇有完整組織樣的蠟帶使用。常規蘇木精-伊紅（haematoxylineosin，HΕ）染色。病理診斷參照WHO 2005年的診斷標準。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計，對數據進行方差分析、LSD-t及χ2檢驗。

2 結果

實驗組1只小鼠在實驗第2周時不明原因死亡，實驗結束時可評價小鼠84只。

2.1 大體觀察

全身狀況：對照組小鼠在整個實驗過程中活動程度、精神狀態、飲食、排便正常，小鼠體質量隨實驗進行緩慢增長。實驗組小鼠在實驗早期精神狀態、活動能力及飲食、飲水正常，實驗后期（25周時）部分小鼠出現行動遲緩、呆滯、喜蜷縮于角落、發抖、毛色不再光亮等病態狀況；體質量在早期逐漸上升，至12周時達到最高水平，隨后呈現下降趨勢。在4、6、8、24、26、28時3組間的小鼠體質量有統計學差異，實驗組24周后體質量較對照組明顯降低（圖1，P<0.05）。其中，2個對照組間體質量無統計學差異，實驗組與對照組間有統計學差異。

2.2 口腔黏膜

對照組：動物口腔黏膜光滑呈淡粉紅色，富彈性，無斑塊、顆粒、潰瘍、糜爛及增生物等病變形成。實驗組：第8周出現白色斑塊樣病損，第10周出現顆粒樣病變，第14周舌背出現突起物。病變的數量隨實驗進程逐漸增加，24周時達到最多。實驗動物的舌、口底、上腭、頰部共出現79處肉眼可見的病變，其中舌部病變70處（88.6%），口底、上腭、頰部分別為3、2、4處，共占11.4%（圖2～4）。

圖1 小鼠不同時期體質量變化Fig 1 Variantion of mice weight during experience

圖2 小鼠頰部（鑷子尖端）、舌尖（鑷子尖端下方）肉眼可見新生物Fig 2 Mess occurred on bucca(at the tip of forceps)and tongue(below the tip of forceps)

圖3 24周舌多發病灶Fig 3 Lingual multiple lesions at 24 week

圖4 肉眼觀察實驗組小鼠不同時期口腔黏膜病變數量Fig 4 Quantity of mucosal lesions by macroscopic observation during experience

2.3 組織病理學

對照組未見病變，實驗組動物在不同時間點黏膜病變不同（圖5，6）。

圖5 舌黏膜病理變化 HΕ× 400Fig 5 Pathological results of lingual mucosal lesions HΕ× 400

圖6 實驗組不同時期病理診斷結果Fig 6 Pathological results in experiment group

實驗組動物第8周出現單純性增生和輕度異常增生，第12周出現中度異常增生，第16周出現重度異常增生，第20周出現原位癌，第24周出現早期浸潤癌。28周時均發生高分化鱗狀細胞癌。所有的癌變組織均被診斷為高分化鱗狀細胞癌，未見有中、低分化鱗癌。

將單純性增生、輕度異常增生、中度異常增生歸為早期病變，重度異常增生、原位癌、早期浸潤癌歸為中晚期病變。在12周與16周時實驗組黏膜病變無統計學差異（P=0.196），16周與20周時有統計學差異（P=0.003），20、24、28周時無統計學差別（P=0.071）。

3 討論

建立口腔癌動物模型的方法主要有化學藥物誘導法、移植瘤法、轉基因法。移植瘤法是將活體腫瘤組織植入小鼠及裸鼠口腔內達到誘導口腔癌的發生。其缺點是需要將大量腫瘤細胞或組織植入皮下或肌肉內，移植后腫瘤發生率及轉移率易受到宿主機體免疫功能的影響。轉基因法是將外源重組基因轉染并整合到動物受體細胞基因組中或抑制/敲除動物的特定基因，從而增強或失活某些基因的表達。該技術存在轉錄效率低、轉基因在宿主基因中的行為難以控制及轉基因不能正常表達等缺點。

20世紀中期采用化學藥物DMBA成功誘導了金黃地鼠頰囊癌變[6]，然而該模型與人類口腔癌相比存在明顯的差別。在解剖上，人類口腔中沒有頰囊這一解剖結構，地鼠頰囊免疫排異功能較差，可接受同種異體組織移植；在組織學上，地鼠頰囊黏膜較人類口腔黏膜更薄，且黏膜固有層包含結締組織；在腫瘤的演化進程上，DMBA誘導的癌變發生在藥物持續刺激的過程中，從而使得因藥物接觸導致的黏膜上皮細胞發生的可逆變化和真正的不可逆的癌前病變無法區分，而人類口腔癌的發生被認為是致癌物間斷性刺激導致細胞突變的逐漸累積，最終進入不可逆轉的癌變進程。DMBA誘導鱗癌的發生經過乳頭狀瘤這一過程，而人類鱗癌卻很少發生在乳頭狀瘤之后。4NQO誘導的大鼠、小鼠口腔黏膜癌模型與DMBA誘發金黃地鼠頰囊癌模型相比有以下4個優點。1）無論小鼠還是大鼠口腔黏膜在解剖和組織結構上與人類更相似。2）4NQO無論通過溶于水飲用還是局部涂抹，均可導致黏膜癌變。這一過程與人類口腔癌的發生是平行的，即黏膜發育不良的病理改變是由于長期小劑量攝入致癌物所致[7]。3）4NQO對黏膜無刺激，在誘癌早期不產生炎癥反應，不影響對早期病理變化的診斷。4）誘癌過程經歷增生、發育不良和高分化鱗癌等階段，與人口腔癌的發生過程相似。

不同給藥濃度和給藥時間對腫瘤的誘導結果有影響。Chang等[8]用200 mg·L-14NQO給藥8周后，在第28周時成功誘導出舌癌。李晶等[9]利用200 mg·L-14NQO給藥17～20周，在24周時誘導出小鼠胃及食道癌，而舌黏膜僅見中度異常增生。本實驗利用終濃度為50 mg·L-1的4NQO給藥16周，C57BL/6小鼠28周時的誘癌成功率為100%。腫瘤誘發的進程及結果與其他學者[10]的相似。本研究中實驗動物的損失率僅為1.2%（1/85）。盡管給藥時間較長，但由于采用自由飲水法，故所需操作并不復雜。

本實驗腫瘤的誘導從小鼠8周齡開始，24～28周時腫瘤形成。該過程跨越動物的生長期（出生后4～8周）、青春后期、性成熟期、體成熟期、中老年期，成瘤過程漫長，與人類口腔癌的自然病程相似。4NQO誘導C57BL/6小鼠口腔黏膜成癌，經歷了單純性上皮增生、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、原位癌、早期浸潤性癌的經典病理過程，與人類口腔癌病理進程相似。

本研究成功建立了舌癌動物模型，實驗12～16周及20～28周在黏膜病變病理上分別對應著早期和中晚期，而且個體間的病變一致性良好，可作為研究舌黏膜癌變早期和中晚期階段的時間點。

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