“O”型口蹄疫正向間接血凝試驗的操作體會

劉俊青 山西省長治市郊區(qū)畜牧獸醫(yī)局 046000

正向間接血凝試驗是目前我國各地動物防疫監(jiān)督機構(gòu)對口蹄疫進行免疫抗體水平檢測廣泛采用的試驗方法。該方法具有操作簡易、快捷、特異、既可定性又可定量等優(yōu)點，所需試驗設(shè)備簡單，具備一般條件的實驗室即能完成實驗操作。但是實驗結(jié)果受操作技術(shù)影響很大，保證實驗操作的細節(jié)是獲取正確結(jié)果的關(guān)鍵所在。

1 原理

抗原與其對應(yīng)的抗體相遇時，在一定條件下會形成抗原抗體復合物，但這種復合物的分子團很小，肉眼看不見。若將抗原吸附在（致敏）經(jīng)過特殊處理的紅細胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的反應(yīng)靈敏性。這種經(jīng)過口蹄疫純化抗原致敏的紅細胞與口蹄疫抗體相遇，紅細胞便出現(xiàn)清晰可見的凝集現(xiàn)象。在間接血凝試驗中，紅細胞具有抗原載體和指示劑的雙重作用。

2 實驗器材

本實驗所使用的實驗器材包括微量血凝板、微量振蕩器和8 道移液器。為了保證實驗的順利進行，要選擇質(zhì)量有保障、穩(wěn)定性好的器材。

（1）微量血凝板。96 孔110°V 型醫(yī)用血凝板，此板可以疊放，但每次用完需要清洗。清洗方法：用過的血凝板應(yīng)及時用高壓清水沖凈，再用5%的鹽酸浸泡48 小時，最后用蒸餾水或去離子水沖洗2次，甩干板子倒置于37℃溫箱中烘干備用。用前要先檢查血凝板孔底是否干凈，如發(fā)現(xiàn)有透光性差一點的孔，可用酒精棉簽擦凈。

（2）微量振蕩器。使用振蕩器振蕩時間不宜超過1 分鐘，振蕩強度不能太大，多塊板疊加后振蕩時要用手壓住最上一板，以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實驗結(jié)果的準確性。

（3）單、多道微量移液器。建議使用高質(zhì)量的移液器，吸取液體時動作要輕緩，防止氣泡產(chǎn)生。移液器屬精密器械，用完后需用75%的酒精棉擦拭，并把刻度調(diào)到最大值。

（4）吸嘴。吸嘴多為一次性消耗品。

3 試劑

（1）抗原。正向血凝抗原搖勻后呈棕紅色或咖啡色，無塊狀物沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液體，搖勻后仍有小塊黑色沉淀物（血球團）的抗原，建議不要使用。1 瓶抗原可以檢測18～20 份血清。抗原2~8℃保存，保存期3 個月，切勿凍結(jié)。

（2）對照血清。陰性對照血清呈淡黃色液體，陽性對照血清呈微紅或淡黃色稍渾濁液體。一般情況下2～8℃保存，保存期為3 個月。

（3）稀釋液。稀釋液無色透明，低溫下放置，瓶底易析出少量結(jié)晶，在水浴中加溫后即可全溶。一般情況2~8℃保存，保存期3 個月。

4 樣品血清

待檢血清要保證新鮮、清亮透明，未檢血清在-20℃保存。同時避免血清反復凍融影響檢測結(jié)果。

5 實驗過程

正向血凝實驗過程包括：加稀釋液、稀釋待檢血清、稀釋陰陽性血清、加血凝抗原、震蕩靜置和結(jié)果判定。在試驗中要注意以下問題。

（1）加稀釋液。在血凝板上1~7 排的1~10 孔、第8 排的1~4 孔和第5～7 孔，加稀釋液50μL/孔。

（2）稀釋待檢血清。取待檢滅活血清樣品50μmL，分別加入反應(yīng)板1～6 排的第1 孔中，于稀釋液混勻后吸取50μL 加入第2 孔，依次作2 倍系列稀釋至第10孔，第10 孔混勻后取出50μL 棄去。此時第1 排1~10孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)）依次為1∶2、1∶4、1∶8……1∶256 和1∶1024。每個待檢血清樣品均按上述方法稀釋。在稀釋血清操作時避免產(chǎn)生過多氣泡，注意每取一份血清必須更換吸嘴。

（3）稀釋陽性對照血清。在血凝板上的第7 排第1 孔加陽性血清50μL，2 倍系列稀釋至第10孔。混勻后從該孔取出50μL 丟棄。此時陽性血清的稀釋倍數(shù)依次為1∶2、1∶4、1∶8……1∶1024。

（4）稀釋陰性對照血清。在血凝板上的第8 排第1 孔加陰性血清50μL，對倍稀釋至第4 孔。混勻后從該孔取出50μL 丟棄。此時陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為1∶2、1∶4、1∶8 和1∶16。第5～7 孔為稀釋液對照孔，每孔僅加入50μL 稀釋液。

（5）加血凝抗原。待檢血清各孔、陰陽性對照各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原(充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀)25μL/孔。一次實驗過程應(yīng)選擇同一批號的抗原，并先從稀釋度高的孔加起，避免滴頭和孔內(nèi)的液體直接接觸。

（6）振蕩混勻。將反應(yīng)板置微型振蕩器上震蕩2～3 分鐘，然后在白色背景下觀察直至血球分布均勻，封板膜封板，室溫下靜置1.5～2 小時或?qū)逯帽渲欣洳匮又链稳张卸ńY(jié)果。

6 判定標準

以呈現(xiàn)“++”血凝反應(yīng)的血清最高稀釋度作為該血清的間接血凝抗體效價，血凝反應(yīng)強度如下:“++++”紅細胞全部凝集，形成一層均勻膜，布滿整個孔底；“+++”紅細胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者略?。弧?+”紅細胞在孔底形成薄膜凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀；“+”紅細胞在孔底形成稀薄、散在的少量凝集，孔底有小圓點。

7 值得探討的問題

收到試劑盒應(yīng)立即打開包裝，取出血凝抗原瓶，用力搖動，使粘附在瓶上的紅細胞搖下，否則易出現(xiàn)沉渣，影響使用效果；勿用90°和130°血凝板，嚴禁使用一次性血凝板，以免誤判結(jié)果；嚴重溶血或嚴重污染的血清樣品不易檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)；抗原為懸浮液，每次滴加前應(yīng)充分搖勻，并先從稀釋度高的孔開始加起，同時避免滴頭和孔內(nèi)的液體直接接觸；當陽性血清抗體效價≥1∶256、陰性血清抗體效價≤1∶16、稀釋液對照孔無自凝現(xiàn)象時實驗成立；待檢血清使用前，需經(jīng)過56℃水浴滅活30 分鐘；如果使用不同生產(chǎn)批號的紅細胞抗原復合物來檢測同一血清，應(yīng)先測出這些血凝抗原的效價，然后將效價相同的抗原作為血液抗體檢測之用，這樣就可以保證結(jié)果的準確性，若血凝抗原效價差別較大，則可導致檢測結(jié)果出現(xiàn)誤差甚至錯誤。