膠體金法檢測HIV抗體質控血清的制備及應用

祝 穎，宋小妮

（正安縣疾病預防控制中心，貴州遵義563400）

膠體金法檢測HIV抗體質控血清的制備及應用

祝 穎，宋小妮

（正安縣疾病預防控制中心，貴州遵義563400）

目的 制備適合膠體金法檢測人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體的質控血清，以監控膠體金試劑的質量變化和檢驗過程中各種因素對檢測結果的影響。方法 用健康人（肝炎標志物和HIV抗體均陰性）血清倍比稀釋經確證的HIV抗體陽性者血清。結果 在環境溫度15～30℃，根據陽性血清濃度選擇稀釋0～16倍的血清作為膠體金試劑的質控血清，試驗5min能均一穩定顯色判讀結果。結論 膠體金法檢測HIV抗體快速、簡便，可單份測定，試劑易于保存，但易受檢測溫度和時間的影響，需做好室內質量控制才能避免后帶現象出現和弱陽性漏檢。

HIV； 膠體金； HIV抗體； 免疫血清； 血液稀釋； 質量控制

艾滋病是一種嚴重破壞人體免疫系統，使感染者易患機會性感染或腫瘤而喪失勞動力直至死亡的重大傳染病。隨著我國各項艾滋病防治措施的有效落實，疫情的上升速度有所減緩，2009年全球艾滋病流行報告顯示，我國目前存活的艾滋病病毒感染者和患者約74萬，但只有不到1/3的感染者得到了診斷[1]，還有很多感染者和患者沒有被發現，其在不知道自己感染人類免疫缺陷病毒（HIV）的狀況下將病毒傳播給配偶或他人，易導致更廣泛的流行傳播。因此，擴大檢測范圍，推廣HIV抗體快速檢測，最大限度地盡早發現感染者并實施治療成為艾滋病防治的主要策略之一[2]。膠體金法作為HIV快速檢測的方法之一，不需要貴重的實驗設備和專門的實驗室，可用全血（指血），不需要離心，結果易解釋，更適合急診患者、孕產婦、求詢者、職業暴露等人員快速取得檢測結果[3]。膠體金試劑的檢測結果易受環境溫度和操作人員操作技能的影響而出現變化，所以，制備質控血清有利于提高檢測的準確性和可靠性。現將膠體金法檢測HIV抗體質控血清的制備方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 A試劑：珠海麗珠HIV（1+2型）抗體第三代酶聯試劑；B試劑：珠海麗珠膠體金試劑盒；C試劑：北京萬泰膠體金試劑盒。試劑均在有效期內，經國家批批檢驗合格。

1.1.2 儀器 生物安全柜、離心機、移液器、安圖酶標儀2010、安圖洗板機fludio、計時器等。

1.2 方法

1.2.1 原始質控血清收集 用無菌血清管分別收集經免疫印跡試驗確證的HIV抗體陽性者血清（蛋白條帶齊全）作為原始陽性血清和HIV抗體陰性的健康人血清作為稀釋血清。所有血清要求外觀無溶血、脂血、黃疸，無細菌污染，肝炎標志物和類風濕因子均陰性。

1.2.2 陽性血清處理 將收集的陰、陽性血清用離心機3 000 r/min離心15min去除蛋白質沉淀，56℃加熱30min滅活處理[4]。

1.2.3 陽性血清檢測 將已處理好的陽性血清用A試劑按照說明書進行雙孔檢測取其S/CO均值，實驗在A試劑的質控范圍內方有效。

1.2.4 質控血清的制備 在生物安全柜內，根據陽性血清S/CO分別選擇強陽、中值陽、弱陽3個濃度用陰性血清按1∶1至1∶32倍比稀釋，反復混勻[5]。

1.2.5 質控血清檢測 將膠體金試劑平衡至室溫（15～30℃），分別取50μL制備好的各稀釋度血清和稀釋液加在加樣區，30min內判讀結果。試驗一直進行到使膠體金試劑不顯色的稀釋度為止，同時記錄膠體金試劑均一、穩定顯色的時間。同一稀釋度做2～3個平行試驗觀察重復性。

2 結 果

2.1 敏感性測定 各濃度不同稀釋倍數血清在20℃、試驗5min的結果見表1。

表1 各濃度不同稀釋度血清檢測結果

2.2 最佳檢測溫度及時間 檢測溫度在15～30℃時，各稀釋度血清在膠體金試劑上5min均能穩定顯色，但強陽性血清穩定顯色的時間約10 min。當溫度高于35℃時，高、低濃度血清均瞬間出現強陽性，陰性血清仍為陰性。

2.3 分裝、保存 經上述步驟，選擇強陽性血清1∶16稀釋、中值陽性血清1∶4稀釋、弱陽性血清不稀釋作為日常檢測的質控血清。按每周使用量為每管300μL進行分裝，置-20℃冰箱保存待用，盡量減少反復凍融，防止弱陽性質控血清滴度下降變為陰性[6]。

2.4 穩定性測定 穩定性是質控品最重要的特性，如果質控品缺乏應有的穩定性，就失去了做質控的意義[7]。將上面篩選所得的3種自制質控血清復融保存于4℃冰箱1～7 d，每天分別用B、C試劑檢測。結果顯示，自制質控血清用2個廠家膠體金試劑檢測穩定性、重復性均較好，見表2。

表2 自制質控血清復融后7 d檢測結果

3 討 論

近年來，國產HIV抗體快速診斷試劑的質量不斷提高，經國家艾滋病檢測試劑臨床質量評估，大多數快速檢測試劑的敏感性、特異性、功效率與進口試劑已無明顯差別，個別還好于進口試劑，甚至接近或達到了酶聯試劑的質量標準要求。膠體金檢測HIV抗體簡便快速、易操作、結果判定直觀，但也有其局限性，當檢測樣品中含有特異性干擾物（類風濕因子、結合蛋白、嗜異性抗體、人抗動物抗體和藥物及其代謝物等）[8]和較高的三酰甘油或大量溶血時，會影響到樣品及膠體金在硝酸纖維膜上的層析，可能出現錯誤的檢測結果[5]。

室內質控是實驗室獲得可靠測定結果的關鍵，決定著實驗的可重復性、精密度[9]。實際工作中，多數實驗室人員普遍將試劑“對照線”作為質控線，基本不用質控血清做室內質控。事實上，“對照線”是游離的膠體金標記重組Au-HIV1/2-Ag和HIV多克隆抗體結合而富集顯色，不需要待測物的參與，只能作為實驗成功與否或檢測試劑是否失效的參考指標，并不能反映試劑檢測HIV抗體的敏感性、特異性、重復性等質量指標。靈敏度的變化最容易觀察，所以，可將敏感性檢測作為室內質控的主要途徑。無論是不同廠家的試劑或同一廠家不同批次的試劑，都應在檢測前每天用質控血清檢測其敏感性，確保當天檢測結果的準確有效，對重復檢測2次均陽性的樣品需用ELISA復檢，當ELISA復檢陽性，則需經Western blooting確證。由于各地HIV快速檢測點發現的陽性樣品都必須送往上級實驗室復檢，不易獲得經確證的HIV抗體陽性血清，故膠體金法檢測HIV抗體的質控血清最好由確證實驗室或篩查中心實驗室制備并分發給篩查點。由于不同廠家膠體金試劑所用抗原不盡相同，制備質控血清最好選擇蛋白條帶齊全的陽性血清，不能用ELISA試劑盒中的陽性對照稀釋制備。陰性稀釋液選用健康人群HIV抗體陰性的血清，而不用小牛血清、PBS和生理鹽水，是為了保證質控血清中的蛋白質處于天然的濃度和狀態，與檢測樣本處于同一體系，更有利于質控[10]。

總之，膠體金檢測HIV抗體有優勢，也有不足，總體上利大于弊。通過做好質控血清的應用，加強實驗人員的操作技能和責任心，嚴格按照試劑說明書進行實驗，避免誤判、漏判，可廣泛推廣應用于我國基層醫療衛生機構，增加自愿咨詢檢測（VCT）覆蓋面，降低VCT成本[11]，以盡早發現更多的隱性感染者，對其有效管理提供技術支持。

[1]聯合國艾滋病規劃署.2009年全球艾滋病流行報告[EB/OL].（2009-11-24）[2014-08-21].http：//www.unchinaids.org.cn/n16/n1058/297763.html.

[2]邢文革，蔣巖.HIV抗體快速檢測試驗的臨床應用[J].中華醫學實踐雜志，2005，4（1）：24-26.

[3]韋興強，韋東祿，邱濤.HIV抗體快速檢測現狀及其推廣應用[J].中國保健營養，2012，14（9）：3561-3562.

[4]中國疾病預防控制中心.全國艾滋病檢測技術規范（2009修訂版）[M].北京：中國疾病預防控制中心，2009：1-81.

[5]徐大葉，周克捷.艾滋病實驗室HIV抗體血清室間盲樣考核的制備及分析[J].現代預防醫學，2013，40（12）：2334-2336.

[6]楊萬琴.HIV抗體外部質控血清制備的探討[J].當代醫學，2009，15（31）：154.

[7]芮橋安.血清免疫實驗室弱陽性室內質控血清的制備及應用[J].昆明醫學院學報，2012（1B）：296-297.

[8]李紅宇，陶艷兵，汪安武，等.HIV初篩檢測的室內質控結果分析[J].中國艾滋病性病，2013，19（5）：363-366.

[9]宮輝，高玲娟.抗HIV抗體弱陽性質控血清的制備及應用評價[J].中國衛生檢驗雜志，2014，24（21）：3092-3093.

[10]邊仕超，馬兆瑾，馬名駒，等.ELISA檢測HIV抗體弱陽性外部質控血漿的制備和應用[J].預防醫學情報雜志，2013，29（2）：149-151.

[11]冉艷紅，李慧，孫江平，等.艾滋病自愿咨詢檢測進展與我國現狀[J].中國艾滋病性病，2008，14（2）：204-206.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.039

B

1009-5519（2015）09-1376-03

2014-12-16）

祝穎（1979-），男，貴州遵義人，主管檢驗師，主要從事艾滋病監測、檢測工作；E-mail：zhu-ying@163.com。