載藥組織工程支架的構(gòu)建及其性能研究

向柄彥，郭 元

（1.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州563000，2.玉田縣醫(yī)院，河北唐山641000）

載藥組織工程支架的構(gòu)建及其性能研究

向柄彥，郭 元

（1.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州563000，2.玉田縣醫(yī)院，河北唐山641000）

目的 構(gòu)建含有萬(wàn)古霉素和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）微球的組織工程支架，并研究其性能，為后期慢性骨髓炎的治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 取殼聚糖溶液、納米羥基磷灰石適當(dāng)比例混合，倒入準(zhǔn)備好的鑄模槽，通過(guò)凍干技術(shù)與化學(xué)交聯(lián)方法制備成固體材料，并置于含有rhBMP-2/聚乳酸（PLA）和萬(wàn)古霉素/PLA緩釋微球溶液中，-80℃冷凍2 h后放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥12 h，用60Co輻照消毒備用，并檢測(cè)支架性能及萬(wàn)古霉素和rhBMP-2的釋放效率，繪制釋放曲線。結(jié)果 所構(gòu)建的納米羥基磷灰石/殼聚糖（n-HA/CS）支架孔徑大小為80～270μm，平均146.53 μm；rhBMP-2/PLA和萬(wàn)古霉素/PLA緩釋微球成團(tuán)狀均勻分布于載藥支架的孔隙中；載藥支架能夠較穩(wěn)定的釋放萬(wàn)古霉素和rhBMP-2，持續(xù)時(shí)間約18 d，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)釋放量逐漸減少。結(jié)論 構(gòu)建的載藥組織工程支架具有良好的生物性能及釋放效率，有望成為一種新型、優(yōu)良的復(fù)合骨組織工程支架材料。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類(lèi)； 重組蛋白質(zhì)類(lèi)； 萬(wàn)古霉素； 遲效制劑； 微球體； 支架； 骨疾病

慢性骨髓炎骨缺損的治療一直是困擾骨科醫(yī)生的難題之一[1-2]。骨組織工程學(xué)研究的進(jìn)步為慢性骨髓炎骨缺損的治療帶來(lái)了新思路、新方法，通過(guò)將細(xì)胞因子復(fù)合生物支架材料修復(fù)骨缺損載藥組織工程支架已成為骨組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)使用聚乳酸（poly lactic acid，PLA）為緩釋載體，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法成功制備出的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（recombinanthuman bonemorphogenetic protein-2，rhBMP-2）/PLA緩釋微球和萬(wàn)古霉素/PLA緩釋微球，并整合到納米羥基磷灰石/殼聚糖（n-HA/CS）生物支架中，對(duì)其生物性能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 納米羥基磷灰石、殼聚糖（山東濰坊市海之源生物公司）；萬(wàn)古霉素（韓國(guó)希杰有限公司）；冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；S-3400N掃描電鏡（日立公司）；rhBMP-2（上海生工生物工程有限公司）；ATCC29210金黃色葡萄球菌由遵義市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 rhBMP-2/PLA和萬(wàn)古霉素/PLA緩釋微球n-HA/CS生物支架的制備 根據(jù)Ma等[4]等方法將殼聚糖溶液、納米羥基磷灰石適當(dāng)比例混合，倒入準(zhǔn)備好的鑄模槽，通過(guò)凍干技術(shù)與化學(xué)交聯(lián)方法制備成固體材料，并進(jìn)入含有rhBMP-2/PLA和萬(wàn)古霉素/PLA緩釋微球溶液中，-80℃冷凍2 h后放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥12 h，用60Co輻照消毒備用。

1.2.2 載藥組織工程支架的性能測(cè)定 采用掃描電鏡檢測(cè)觀察空隙形貌，用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)支架材料的抗壓能力，觀察是否符合實(shí)驗(yàn)要求。將制備成功的固體材料放置4℃冰箱保存。

1.2.3 載藥組織工程支架的體外抑菌實(shí)驗(yàn) 將支架材料置于接種金黃色葡萄球菌的瓊脂固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用卡尺測(cè)量抑菌的范圍，取出支架材料重新置于接種金黃色葡萄球菌的瓊脂固體培養(yǎng)基中。以后每2天測(cè)量1次抑菌范圍并更換培養(yǎng)基，直至不再出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.4 緩釋微球萬(wàn)古霉素及rhBMP-2釋放效率的測(cè)定 稱(chēng)取10mg rhBMP-2/PLA和萬(wàn)古霉素緩釋微球溶于適量雙蒸水，每隔2 d用ELISA法測(cè)定溶液中rhBMP-2和萬(wàn)古霉素的濃度，并每2天移去原溶液50%溶液，并用無(wú)菌PBS補(bǔ)充至原量。根據(jù)測(cè)定值繪制釋放曲線。

2 結(jié) 果

2.1 支架材料的電鏡掃描及生物力學(xué)測(cè)試 支架材料經(jīng)電鏡掃描后呈現(xiàn)出豐富的不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)，各孔之間相通性好，孔徑大小為80～270μm，平均孔徑為146.53μm。見(jiàn)圖1。

圖1 支架材料電鏡掃描

2.2 緩釋微球整合情況觀察 掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，rhBMP-2/PLA和萬(wàn)古霉素/PLA緩釋微球均勻緊密地黏附在n-HA/CS支架的孔隙中，部分緩釋微球成團(tuán)狀分布。見(jiàn)圖2。

圖2 載藥組織支架材料的電鏡掃描

2.3 載藥支架材料的體外抑菌性能 載藥材料在體外能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，其抑菌作用持續(xù)25 d；隨著時(shí)間推移，抑菌范圍不斷縮小。見(jiàn)圖3。

2.4 萬(wàn)古霉素/PLA、rhBMP-2/PLA釋放效率 萬(wàn)古霉素/PLA和rhBMP-2/PLA均可持續(xù)緩慢釋放，其持續(xù)時(shí)間可達(dá)18 d，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)釋放量逐步下降。見(jiàn)圖4。

圖3 載藥支架材料體外抑菌性能

圖4 萬(wàn)古霉素/PLA、rhBMP-2/PLA釋放效率測(cè)定

3 討 論

慢性骨髓炎的治療是骨科疾病的難題。近年來(lái)，隨著抗生素的不斷升級(jí)及骨科診療技術(shù)的不斷進(jìn)步，臨床對(duì)骨髓炎的治愈率不斷提高，但治療效果仍不理想。目前慢性骨髓炎的治療主要包括徹底清創(chuàng)、持續(xù)沖洗及抗生素的應(yīng)用[5]。抗生素的長(zhǎng)期應(yīng)用存在多種不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、耳毒性、腎毒性及骨髓抑制等。研究表明，局部應(yīng)用抗生素可達(dá)到有效濃度并減輕不良反應(yīng)。最早應(yīng)用于臨床的載藥植入材料是一種聚甲基丙烯酸甲酯，其植入體內(nèi)后會(huì)放熱，單體成分對(duì)人體具有毒性，組織相容性差，需二次手術(shù)取出，患者創(chuàng)傷及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，限制了其臨床應(yīng)用[6-7]。因此，研發(fā)新的局部抗生素緩釋系統(tǒng)，可為慢性骨髓炎提供新的治療方案。

作為骨組織工程理想支架材料應(yīng)當(dāng)具有很好的生物相容性、可降解性及適宜的機(jī)械強(qiáng)度等。殼聚糖、羥基磷灰石均為天然材料，具有良好的生物相容性，但單獨(dú)應(yīng)用制成支架均存在一定的缺陷。葉鵬等[8]將絲素蛋白、殼聚糖、納米羥基磷灰石通過(guò)冷凍干燥法與化學(xué)交聯(lián)技術(shù)制備成生物支架，其相關(guān)檢測(cè)達(dá)到骨組織工程支架的基本要求。rhBMP-2是經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的最重要的骨誘導(dǎo)因子，是控制骨缺損修復(fù)信號(hào)通路的必需成分，是目前骨組織工程研究最多和應(yīng)用最廣泛的生長(zhǎng)因子[9-10]。但因其半衰期短，在局部組織中易被降解或在體液中快速擴(kuò)散，難以在骨缺損部位持續(xù)誘導(dǎo)成骨[11]。因此，構(gòu)建能夠持續(xù)釋放rhBMP-2的緩釋系統(tǒng)對(duì)骨缺損修復(fù)具有重要意義。

PLA具有良好的生物相容性及可降解性，最終代謝產(chǎn)物為水和二氧化碳，是美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用的醫(yī)療高分子可降解材料。目前應(yīng)用PLA作為緩釋載體制備的化療藥物、激素、胰島素、抗生素等緩釋藥物取得了良好療效，部分已應(yīng)用于臨床[12-14]。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，本課題選用PLA作為rhBMP-2的緩釋載體，通過(guò)制作符合生物力學(xué)要求的生物工程支架材料，并負(fù)載萬(wàn)古霉素和rhBMP-2，使其在體內(nèi)緩慢釋放，達(dá)到局部有效濃度，為慢性骨髓炎的治療和骨愈合提供良好環(huán)境。

綜上所述，本研究構(gòu)建的載藥組織工程支架材料具有良好的生物學(xué)性能，其載藥釋放效率高、時(shí)間長(zhǎng)，有望成為一種新型、優(yōu)良的復(fù)合骨組織工程支架材料。

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Establishmentofdrug-loaded tissueengineering scaffoldsand itsproperties

Xiang Bingyan，Guo Yuan
（1.The FirstPeople′s Hospitalof Zunyi，Guizhou 563000，China；2.Yutian County Hospital，Tangshan，Hebei641000，China）

Objective To establish tissue engineering scaffolds containing vancomycin and rhBMP-2microspheresand investigate its performance，which providesexperimentalbasis for the treatmentof later chronic osteomyelitis.M ethods The chitosan solution and nano hydroxyapatite weremixed in appropriate proportion，and then poured into themould slot prepared by freeze-drying technique and chemical cross-linking method for preparing solid material and turned into solution containing rhBMP-2/PLA polylactic acid and vancomycin/PLA releasemicrospheres.After frozen in-80℃for 2 h and then put into the vacuum freeze drier to dry for 12 h，sterilized with60Co irradiation for preparation，the release efficiency detection support performance and vancomycin and rhBMP-2，itwas detected scaffolds performance and release efficiency of vancomycin and rhBMP-2 microspheres aswellas drawing the release curve.Results The pore size of n-HA/CSscaffolds in this study was 80-270μm，with an average of 146.53μm.The rhBMP-2/PLA and vancomycin/PLA sustained releasemicrosphere were distributed in the gaps of drug-loaded scaffolds inmolding.The drug-loaded scaffoldswas available to release rhBMP-2 and vancomycin steadily，lasting about18 d.with the time prolonged，the release amountdecreased.Conclusion The drug-loaded tissue engineering scaffolds containsa good biologicalproperties and release efficiency，being expected to become a new and fine composite bone tissue engineering scaffolds.

Bonemorphogenetic proteins； Recombinant proteins； Vancomycin； Delayed-action preparations；Microspheres； Stents； Bone diseases

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.001

A

1009-5519（2015）09-1281-02

2014-12-06）

貴州省遵義市科技局、遵義市第一人民醫(yī)院聯(lián)合基金項(xiàng)目（遵義科社合字[2013]1號(hào)）。

向柄彥（1978-），男，貴州遵義人，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)創(chuàng)傷外科的研究；E-mail：xby1978@126.com。