雙波長HPLC同時測定氮沉降處理下杜仲皮和葉中的5種成分

哀建國，杜江麗，周愛存，金松恒，宋新章

雙波長HPLC同時測定氮沉降處理下杜仲皮和葉中的5種成分

哀建國1，杜江麗2，周愛存2，金松恒2，宋新章2

（1.浙江農林大學 信息工程學院，浙江 臨安 311300；2.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安311300）

建立雙波長高效液相色譜法（HPLC）同時測定模擬氮沉降處理下杜仲Eucommia uimoides皮和葉中松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷等5種活性成分含量的方法。采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-2.0 g·kg-1磷酸水溶液（B）進行梯度洗脫（0～12 min，10%A；12～25 min，13%A；25～50 min，30%A；50～65 min，60%A）；流速為0.8 mL·min-1；檢測波長203 nm，240 nm；柱溫30℃。結果表明：松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷等在各自的線性范圍內與其峰面積積分值呈良好的線性關系。整個實驗期間，杜仲皮和葉中5種成分含量對施氮處理產生了不同的響應，且隨季節在變動。該方法能準確、快速地對杜仲皮和葉中多種有效成分同時進行測定，可較好反映浙江高氮沉降區特色名貴藥材杜仲皮和葉中多種有效成分的變化。圖3表6參13

經濟林學；杜仲；模擬氮沉降；藥用成分；雙波長高效液相色譜法

杜仲Eucommia ulmoides又名思仙、思仲、木棉等，是中國特有的貴重中藥材和工業提膠原料樹種。杜仲自古便被列為中藥上品。近代醫學進一步研究表明，它的一些重要次生代謝物如松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、桃葉珊瑚苷和黃酮等具有利膽、降壓、調節血脂、抗菌、抗氧化、增強免疫力及興奮中樞神經系統等多種藥理作用［1］。杜仲在國內栽培區域大致位于華東、華中和西南暖溫帶氣候區內［2］，其分布區大體上和長江流域相吻合，而此區域亦是中國氮沉降分布最集中地區。目前，氮沉降對植物光合生理［3-4］、生產力［5-7］、營養元素含量［8-9］等的影響研究較多，但大多是以農作物、經濟作物和部分森林樹種或整個森林生態系統為對象，對藥用植物特別是木本藥用植物研究較少，對其藥用成分含量影響的研究更是鳳毛麟角。此外，在杜仲活性成分檢測分析方面亦有很多報道，主要是測定杜仲葉中綠原酸或杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量［10-13］，而同時檢測杜仲皮和葉中多種活性成分的研究相對較少。為提高浙江高氮沉降區特色名貴藥材杜仲的藥性品質，本研究建立雙波長高效液相色譜法（HPLC）同時測定模擬氮沉降處理下的杜仲幼苗皮和葉中5種活性成分的質量分數，這對于增強浙江省道地藥材杜仲的國內外市場競爭力具有十分迫切的必要性和現實意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀（Waters 2996 DAD檢測器）；AP-01P真空泵（杭州賽析科技有限公司）；4504MP電子天平（萬分之一）；SK8200HP-超聲波清洗器（上?？茖В粩碉@恒溫水浴鍋（HH-4，江蘇環宇科學儀器廠）；DZF-0真空干燥箱（上海躍進醫療器械廠）。

1.2 試藥

流動相用乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純，均購于臨安卡爾生物技術有限公司。水為娃哈哈純凈水。松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷等對照品購于上海金穗生物科技有限公司 （批號：20130919，20130903，20130913，20120828，20130902，質量分數均≥98%）；杜仲葉和皮采自浙江省臨安市浙江農林大學杜仲幼苗試驗大棚。采集前，結合目前杭州地區的氮沉降量（30.9 kg·hm-2·a-1），將受試杜仲苗分為對照（ck：0 kg·hm-2·a-1）,低氮（LN：30 kg·hm-2·a-1）,中氮（MN：60 kg·hm-2·a-1）等3個處理組，于2013年5-10月期間，每月1次定期噴灑配制的不同強度的NH4NO3溶液。模擬氮沉降處理后隔25 d取葉片和樹皮（含對照）帶回實驗室，清洗干凈，80℃烘干，粉碎，并用索氏提取法進行預處理，以除去杜仲膠、葉綠素等脂溶性成分，常溫避光儲藏備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；進樣量30 μL；流動相為乙腈（A）-2.0 g·kg-1磷酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序（0~12 min，10%A；12~25 min，13%A；25~50 min，30%A；50~65 min，60%A）；流速0.8 mL·min-1；檢測波長203 nm（檢測松脂醇二葡萄糖苷和桃葉珊瑚苷）和240 nm（檢測綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷），以保留時間定性，峰面積定量。此色譜條件下對照品與供試品分析圖譜見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取松脂醇二葡萄糖苷（PDG），桃葉珊瑚苷（AU），綠原酸（CA），京尼平苷酸（GPA）和京尼平苷（GP）對照品各4.23，2.66，5.86，3.29和6.4 mg，置同一容量瓶中，加體積分數為50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得到松脂醇二葡萄糖苷0.006 768 g·L-1，桃葉珊瑚苷0.042 56 g·L-1，綠原酸0.028 g·L-1，京尼平苷酸0.052 g·L-1，京尼平苷0.005 12 g·L-1混合對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.3 供試品溶液的制備

準確稱取已除雜的杜仲葉、皮粉末各0.5 g（精確到0.001 g），分別置于50 mL具塞錐形瓶中，各加入25 mL體積分數為70%甲醇，密塞，稱量。超聲提取40 min（功率為180 W，頻率為40 kHz），放冷，再稱量，用體積分數為70%甲醇補足減失的質量，濾過。濾渣同法再提取1遍，合并2次提取液于50 mL容量瓶中，冷卻定容至刻度，搖勻過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

圖1 杜仲皮和葉的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of the bark and leaves of Eucommia uimoides

2.4 線性關系的考察

分別精密吸取混合對照品溶液1，5，10，20，40，70，100 μL進樣，按照 “2.1”項色譜條件測定峰面積。以混合對照品的進樣量（x，μg）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程。結果表明:松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷進樣量與各自色譜峰面積線性關系良好（表1）。

表1 杜仲中5種成分的標準曲線Table 1 Standard curve of five compounds in Eucommia uimoides

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，按照 “2.1”項色譜條件連續進樣6次，記錄松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷峰面積，相對標準誤差分別為1.11%，0.96%，1.08%，1.18%和1.05%。

2.6 穩定性試驗

分別稱取杜仲皮、葉粗粉各5份，0.5 g·份－1，制備供試品溶液。分別精密吸取制備好的供試品溶液20 μL，在0，3，6，9，12，15，24 h各進樣1次，測定各成分峰面積。計算得杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷的相對標準誤差分別為1.18%，1.23%，1.27%，1.39%和1.75%；杜仲葉中桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸的相對標準誤差分別為1.65%，1.32%，1.77%。結果表明：供試品溶液中各成分在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

分別稱取杜仲皮、葉粗粉各5份， 0.25 g·份-1，制備供試品溶液，進樣測定。計算得杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷質量分數的相對標準誤差分別為：1.76%，1.69%，1.88%，1.92%，1.67%；杜仲葉中桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸質量分數的相對標準誤差分別為：2.02%，1.98%，1.87%。結果表明：該方法重復性較好（n=6）。

2.8 加樣回收率試

精密稱取0.25 g已測定的杜仲皮樣品粉末6份，每份分別加入混合對照品溶液適量，制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。對于超過線性范圍的樣品，先稀釋一定倍數后再測定。結果見表2~6。

2.9 樣品測定

取6批2013年5-10月對照（ck）,低氮（LN）和中氮（MN）處理水平下的杜仲葉、皮樣品，依 “2.3”項制備供試品溶液，利用 “2.1”項得到的雙波長-梯度洗脫模式HPLC法對松脂醇二葡萄糖苷（PDG）,桃葉珊瑚苷（AU）,綠原酸（CA）,京尼平苷酸（GPA）和京尼平苷（GP）的質量分數進行測定分析，結果見圖2和圖3。結果顯示:氮沉降處理對杜仲皮和葉中松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷和桃葉珊瑚苷質量分數的影響不盡相同，且不同月份呈現出不同的變化規律。

表2 松脂醇二葡萄糖苷的加樣回收率試驗結果（n＝6）Table 2 Results of recovery tests of PDG（n=6）

表3 桃葉珊瑚苷的加樣回收率試驗結果（n＝6）Table 3 Results of recovery tests of AU（n=6）

表4 綠原酸的加樣回收率試驗結果（n＝6）Table 4 Results of recovery tests of CA（n=6）

表5 京尼平苷酸的加樣回收率試驗結果（n＝6）Table 5 Results of recovery tests of GPA（n＝6）

表6 京尼平苷的加樣回收率試驗結果（n＝6）Table 6 Results of recovery tests of GP（n＝6）

圖2 不同模擬氮沉降對杜仲皮中5種成分質量分數的影響比較Figure 2 Content comparisons of the 5 compounds in the bark of Eucommia uimoides under simulated experiment of nitrogen deposition

圖3 不同模擬氮沉降對杜仲葉中3種成分質量分數的影響比較Figure 3 Content comparisons of the 3 compounds in the leaves of Eucommia uimoides under simulated experiment of nitrogen deposition

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

實驗前對對照品溶液作紫外-可見全波段（200~400 nm）掃描。松脂醇二葡萄糖苷和桃葉珊瑚苷在203 nm附近有最大吸收，該波長下2種成分具有較高的響應值和較好的分離效果；綠原酸在240 nm和324 nm，京尼平苷酸和京尼平苷在240 nm處有較強的紫外吸收，低于240 nm波長時，3種成分吸收峰小，分析準確性較差，但松脂醇二葡萄糖苷和桃葉珊瑚苷在波長大于240 nm后基本無吸收峰。因此，本研究采用DAD檢測器，設定203 nm和240 nm雙波長進行檢測，使5種成分都能在所測波長處有較大吸收，這比單波長測定法更為準確，且穩定快，干擾小。

3.2 流動相梯度的選擇

等度洗脫時，桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸完全重疊，無法分開，且出峰時間太早，不利于樣品中各成分的分離，故采用梯度洗脫。通過對幾種洗脫梯度的比較，最終確定 “2.1”節中的洗脫程序，結果可以實現混合標樣中5種成分的較好分離。此外，從峰形上考慮，該梯度下檢測獲得的色譜峰沒有前伸和拖尾現象，且峰形尖銳，可提高杜仲有效成分的保留，改善色譜分離效果。最終測得松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷的保留時間分別為30.50，4.35，12.80，5.30和20.00 min。

3.3 模擬氮沉降對杜仲主要藥用成分的影響

對不同月份不同模擬氮沉降處理過的受試杜仲苗進行分析，發現皮和葉中各有效成分在不同月份各施氮處理間差異較大。整個研究期間，皮中松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷等的質量分數在低氮組中相對較高，中氮組中則表現出初期抑制，中后期促進的變化規律。推測可能因為低濃度的氮沉降促進了杜仲生長，起到了一定的 “施肥效應”；而中濃度的氮沉降早期對杜仲具有抑制作用，但隨著時間的推移，杜仲對逆境脅迫表現出了一定的適應性和承受力。施氮處理對皮中桃葉珊瑚苷影響很大，低氮組在初期就已經表現出抑制作用，后期施氮處理有助于其含量的積累。杜仲葉中桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸等質量分數對施氮處理較皮敏感。在植物葉片生長的整個時期，低氮和中氮實驗組中3種成分基本都受到不同程度的脅迫，且隨著氮沉降濃度增大而加強。但在中期，中氮處理對葉中桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸質量分數的積累有促進作用，中氮組中3種成分質量分數最高。

本研究首次采用雙波長高效液相色譜法對模擬氮沉降處理下的1年生杜仲苗皮和葉中松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸和京尼平苷等的質量分數進行測定，并進一步對其不同月份不同處理間的變化規律做了分析比較，發現在不同程度模擬氮沉降處理下，皮和葉中5種成分質量分數對施氮處理產生了不同的響應，且隨季節在變動。研究全球環境變化背景下氮沉降對浙江省特色名貴藥材杜仲藥性品質的影響是本研究的一大特色，這對于提高浙江高氮沉降區道地藥材杜仲的藥性品質及市場競爭力具有十分迫切的必要性和現實意義。本方法的建立也可作為杜仲藥材質量控制標準的有效補充。

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Determination of five active components in Eucommia uimoides under simulated experiment of nitrogen deposition by dual-wavelength HPLC

AI Jianguo1，DU Jiangli2，ZHOU Aicun2，JIN Songheng2，SONG Xinzhang2
（1.School of Information Engineering,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang,China）

A method for determination of pinoresinol diglucoside,aucubin,chlorogenic acid,geniposidic acid and geniposide in Eucommia uimoides under simulated experiment of nitrogen deposition by dual wavelength HPLC was established.Dual-wavelength HPLC was adopted performing on Agilent ZORBAX SB-C18column （250 mm×4.6 mm,5 μm）with a mobile phase of acetonitrile （A）-0.2%phosphoric acid （B）at flow rate of 0.8 mL·min-1.The gradient elution program was as follows:0-12 min,10%A;12-25 min,13%A;25-50 min, 30%A;50-65 min,60%A.The detection wavelength was set at 203 nm for pinoresinol diglucoside and aucubin,and at 240 nm for chlorogenic acid,geniposidic acid and geniposide.The column temperature was 30 ℃.Results showed that pinoresinol diglucoside,aucubin,chlorogenic acid,geniposidic acid and geniposide all had a good linear relationship with their peak area values respectively.The five ingredients from bark and leaves of Eucommia uimoides had different response to the nitrogen treatments,and changing in the seasons. The method can be used for simultaneous determination of ingredients in Eucommia uimoides,and can be successfully applied to reflect the content changing of the compounds.［Ch,3 fig.6 tab.13 ref.］

cash forestry;Eucornmia ulmoides;simulated nitrogen deposition;medicinal ingredients;dualwavelength HPLC

S759.3

A

2095-0756（2015）01-0060-07

浙 江 農 林 大 學 學 報，2015，32（1）：60-66

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.009

2014-04-16；

2014-06-24

浙江省自然科學基金資助項目（Y3110393）

哀建國，副教授，博士，從事植被生態學與植物資源開發利用研究。E-mail:aijg1968@zafu.edu.cn