東南景天耐鎘相關基因SaFer的克隆與功能初步分析

趙 婷,韓小嬌， 劉明英，喬桂榮， 蔣 晶， 姜彥成， 卓仁英

東南景天耐鎘相關基因SaFer的克隆與功能初步分析

趙 婷1,2,3,韓小嬌2,3， 劉明英2,3，喬桂榮2,3， 蔣 晶2,3， 姜彥成1， 卓仁英2,3

（1.新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊830046;2.中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，浙江富陽311400;3.中國林業科學研究院林木遺傳育種國家重點實驗室，北京100091）

鐵蛋白（ferritin）是一種專門存儲鐵的重要脅迫相關蛋白，參與鎘離子吸收的調控。從構建的東南景天Sedum alfredii cDNA文庫中篩選出東南景天Ferritin基因cDNA全長，命名為SaFer，編碼序列為1 117 bp，開放閱讀框為759 bp，編碼252個氨基酸。以東南景天基因組DNA為模板分離到SaFer基因組序列，長度為1 702 bp，含有7個內含子。氨基酸序列同源性分析表明：SaFer與蘋果Malus domestica Ferritin親緣關系最近，同源性高達76%。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析發現：根系中SaFer基因在鎘脅迫12 h后表達顯著上調。鎘脅迫實驗顯示，轉基因擬南芥Arabidopsis thaliana比野生型有更高的耐鎘脅迫能力。SaFer基因的分離及其初步功能驗證為研究東南景天耐鎘機制和林木耐鎘轉基因育種提供了理論依據。圖9表1參23

植物學；東南景天；鐵蛋白（ferritin）；鎘脅迫；表達分析

隨著中國工業化的迅速發展，土壤重金屬污染已嚴重影響了食品安全。如何治理土壤重金屬污染已成為國內外的研究熱點。利用超積累植物清除重金屬污染即植物修復技術以其潛在的高效、廉價和環境友好性而獲得了廣泛關注［1］。重金屬超積累植物是指其地上部積累的重金屬離子大于100 mg·kg-1，同時植物的地上部重金屬含量與根系重金屬含量的比值大于1的植物［2-3］。到目前為止，世界各地已經發現的超積累植物共400多種，主要是鎳（Ni）超積累植物，而鎘超積累植物比較少見。目前公認的鎘超積累植物有遏藍菜Thlaspi caerulescens,鼠耳芥Arabidopsis halleri和東南景天Sedum alfredii［4-9］。礦山型東南景天是在浙江省衢州市廢棄的鉛、鋅礦區發現的一種鋅（Zn2+）/鎘（Cd2+）超積累植物［10］。礦山型東南景天是經過自然進化的鎘超積累植物，查清東南景天重金屬超積累的分子機制對林木耐鎘新品種培育具有重要意義。鐵蛋白在植物體內作為一種重要的脅迫反應蛋白參與外界環境脅迫反應。當植物受到寒冷、干旱、重金屬離子等環境脅迫時體內都發現有鐵蛋白的存在［11］。鐵蛋白可以儲存鐵原子，減少鐵介導的自由基反應，從而提高植物的抗脅迫能力［12］。鐵蛋白通過芬頓反應螯合細胞內的鐵，從而保護植物細胞免受因各種環境脅迫而導致的細胞氧化性損傷［13］。此外，鐵蛋白還可以儲存部分重金屬離子，如Cu2+和Zn2+等，通過調節鐵離子濃度來調控代謝所需的金屬離子含量，從而抵御環境脅迫，因此，植物鐵蛋白在緩解重金屬的毒害方面也可能具有一定的作用［14］。目前，尚無東南景天Ferritin基因方面的研究。本研究是從中國林業科學研究院林木遺傳育種國家重點實驗室（本實驗室）前期構建的東南景天cDNA文庫中分離克隆出1個Ferritin基因cDNA，并分析了鎘脅迫條件下東南景天根部中該基因的表達變化，及轉基因擬南芥Arabidopsis thaliana在鎘脅迫下的生理變化，為深入研究東南景天Ferritin基因如何參與鎘脅迫反應機制及其在林木耐鎘轉基因育種中應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株和載體

哥倫比亞生態型擬南芥Col-0，東南景天，大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，Bl21 DE Star，根癌農桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA105，植物表達載體pBI121均由本實驗室保存；pGEM-T Easy載體購自美國Promega公司。

1.2 酶和主要試劑

LA Taq高保真聚合酶、rTaq DNA聚合酶和限制性內切酶Sfi I購自寶生物工程（大連）有限公司，T4 DNA連接酶購自美國Promega公司，核糖核酸（RNA）提取使用總RNA純化試劑盒（NORGEN,加拿大），反轉錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit和熒光定量試劑盒SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit均購自Takara公司（Takara,中國大連），DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司（AXYGEN,中國上海），NANODROP2000分光光度計、ABI 7300實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀、TaKaRa梯度PCR儀、高速冷凍離心機5804R分別購自美國Thermo公司、美國Applied Biosystems公司、日本TaKaRa公司和德國Eppendorf公司，DNA測序和引物合成由生工生物工程 （上海）股份有限公司完成（表1）。

1.3 東南景天SaFer基因組序列克隆及同源性分析

從本實驗室前期構建的東南景天cDNA文庫中篩選出Ferritin基因cDNA全長,利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取東南景天基因組DNA［15］。根據Ferritin基因序列設計特異性引物：ORF-F和ORF-R，以東南景天基因組DNA為模板，PCR反應程序：95℃預變性10min；95℃變性30 s， 56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環；最后72℃延伸10 min。經體積分數為1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，連接T-easy載體，轉化大腸埃希菌DH5α，篩選陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 引物名稱及對應序列Table 1 Name and sequence of primers

將獲得的氨基酸序列與美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中的蛋白質序列進行局部序列比對基本檢索工具（BLAST）比對，分析該基因與其他物種基因的同源性，用MEGA 4.0軟件進行多序列比對并構建系統進化樹。

1.4 東南景天根部SaFer基因鎘脅迫后表達分析

用400 μmol·L-1的氯化鎘（CdCl2）脅迫東南景天無性系植株，脅迫時間分別為0，0.5，6，12，24，48，72和96 h。按照NORGEN的RNA提取試劑盒說明，分別提取東南景天根部總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計測定濃度，并用體積分數為1%的瓊脂糖電泳分析完整性。使用Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉錄合成第1鏈。反轉錄體系為2.0 μL 5×primeScript Buffer,500 ng總RNA,0.5 μL Oligo dT Primer,0.5 μL Random 6 mers,0.5 μL primeScript RTase,用RNase無核糖核酸酶水補足至10.0 μL。反應程序為：37℃/30 min，85℃/5 s，將合成后的cDNA稀釋10倍，用于實時熒光定量PCR。

根據cDNA全長序列設計實時熒光定量PCR引物：Fer-RTF和Fer-RTR。參照試劑盒SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR Kit說明書，以東南景天微管蛋白基因beta-Tubulin（TUB）為內參：TUB-RTF和TUBRTR。反應在ABI 7300實時定量PCR儀上進行，反應體系為：cDNA模板2.0 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM10.0 μL，特異引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用水補足20.0 μL。PCR擴增條件為：95℃30 s預變性后，95℃變性5 s，60℃復性31 s，共40個循環。每個試樣平行做4次反應，重復試驗2次。數據分析采用ΔΔCT法計算相對定量，目標基因相對定量=2-ΔΔCT［16］。

1.5 擬南芥的轉化和篩選

參考楊靚等［17］的方法對載體pBI 121進行改造引入Sfi I酶切位點獲得目的載體pBI121G，利用 sfi 1限制性內切酶對SaFer基因片段和改造后的表達載體pBI121G進行酶切，將相應的目的片段連接后的植物表達載體命名為pBI121G-SaFer，并電激轉化根癌農桿菌EHA105，利用花序浸染法轉化擬南芥，篩選陽性轉基因植株。通過PCR和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測分析轉基因擬南芥的表達模式。

1.6 SaFer轉基因擬南芥的檢測

分別利用SaFer特異引物PCR和RT-PCR相結合篩選轉基因擬南芥陽性植株。擬南芥幼苗移栽于營養土22 d后，根據RNA提取試劑盒說明書分別提取野生型和PCR陽性株系擬南芥葉片總RNA，按照Takara逆轉錄試劑盒說明書對提取得到的總RNA反轉錄，并將合成的cDNA稀釋10倍，用于熒光定量PCR分析。

設計東南景天Ferritin基因熒光定量PCR引物：Fer-RTF和Fer-RTR，以擬南芥Actin為內參基因：AtActin-RTF和AtActin-RTR（表1），反應在ABI 7300實時定量PCR儀上進行。

1.7 轉基因擬南芥的耐鎘性試驗

1.7.1 種子萌發試驗 為了分析不同濃度鎘離子脅迫對擬南芥種子發芽率的影響，將收獲的轉基因擬南芥T3代種子和野生型擬南芥種子經體積分數為75%的乙醇消毒后，挑選均勻飽滿的種子各20粒，播種在含不同氯化鎘濃度（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0 mmol·L-1）的1/2MS的固體培養基上，4℃處理2 d，之后置于23℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養。以胚根突破種皮0.5 mm為萌發標準，每天觀察種子萌發情況，統計萌發數。隨后選擇氯化鎘濃度為1.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1，處理方法同上，每天統計萌發數，分析處理后第7天統計發芽率［18］，發芽率=（供試種子的發芽數/供試種子）×100%。

1.7.2 鎘脅迫條件生理試驗 轉基因擬南芥種子的處理方法同上，在培養基中培養12 d后，移栽至營養土中培養40 d，用含2 mmol·L-1氯化鎘的Hoagland浸泡轉基因擬南芥和野生型擬南芥，以未經處理的轉基因擬南芥和野生型擬南芥為對照，測定處理1,3,6 d后擬南芥葉片的生理指標：超氧化物歧化酶（SOD）活性采用四氮唑藍（NBT）光還原法測定［19］；質膜相對透性用DDS-11A型電導率儀測定［20］。

2 結果與分析

2.1 東南景天SaFer基因cDNA及DNA序列分析

對從東南景天cDNA文庫中篩選出的鐵蛋白基因序列進行生物信息學分析，確認其為全長cDNA序列，將其命名為SaFer（登錄號為KF850427），cDNA長為1 117 bp，含有1個759 bp的開放讀碼框，5′UTR長73 bp，3′UTR長285 bp，編碼252個氨基酸。根據SaFer基因cDNA序列設計特異性引物，以東南景天基因組DNA為模板分離到了SaFer基因組序列，長為1 702 bp（登錄號為KF850428）。序列比對發現，東南景天SaFer基因含有7個內含子，長度與位置分別為104 bp（376~479 bp），67 bp（564~ 630 bp），80 bp（692~771 bp），446 bp（860~1 305 bp），99 bp（1 368~1 466 bp），81 bp（1 533~ 1 613 bp）和66 bp（1 686~1 751 bp）（圖1）。將東南景天SaFer與部分植物蛋白質序列進行比對與親緣關系分析發現（圖2），SaFer與蘋果Malus domestica的同源性最高（76%），而與擬南芥的同源性最低（65%）。

圖1 SaFer基因組結構Figure 1 Gene structure of SaFer

圖2 SaFer與其他植物Ferritin的進化關系Figure 2 Phylogenetic tree besed on Ferritin of Sedum alfredii and other species

2.2 SaFer基因在東南景天根部的表達分析

將提取的根部總RNA經反轉錄后利用qRT-PCR分析SaFer基因的表達情況。從圖3可以看出SaFer基因在東南景天脅迫12 h時表達量最高，為對照的8.5倍，24 h急劇下降至對照的2.0倍，之后隨著脅迫時間的增加，表達量緩慢上升。

2.3 轉基因植株的鑒定

提取轉基因陽性植株和野生型擬南芥葉片的DNA，以SaFer基因的特異引物進行PCR反應，PCR產物電泳結果如圖4所示，轉基因陽性植株可以擴增出約750 bp的目的條帶，而野生型擬南芥沒有PCR產物（WT），選擇其中2個轉基因陽性株系命名為A1-1和A1-2。

提取擬南芥轉基因陽性植株以及野生型植株的總RNA，反轉錄后利用qRT-PCR分析目的基因SaFer的表達情況，從圖5可以看出東南景天SaFer基因在轉基因擬南芥中的表達量遠遠高于野生型擬南芥，而在野生型擬南芥中未檢測到其表達。

圖3 不同脅迫時間SaFer基因的表達分析Figure 3 Expression levels of SaFer at different stress times

圖4 轉基因擬南芥的PCR檢測Figure 4 PCR analysis of transgenic Arabdopsis thaliana

圖5 轉基因擬南芥的表達分析Figure 5 Expression levels of transgenic Arabidopsis thaliana

2.4 轉基因擬南芥的鎘抗性試驗

2.4.1 擬南芥種子的萌發試驗 為了解鎘離子（Cd2+）脅迫對擬南芥種子萌發的影響，需要確定合適的鎘處理濃度。實驗用不同濃度氯化鎘處理轉基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子，觀察其萌發的情況。如圖6所示，Cd2+處理抑制擬南芥種子萌發，且不同濃度的Cd2+對擬南芥種子萌發率的抑制作用差異顯著。在Cd2+濃度為0.5 mmol·L-1時擬南芥種子的萌發率與對照差別不大，隨著Cd2+濃度的增加萌發率下降，到2.0 mmol·L-1明顯下降，說明擬南芥種子對1.5和2.0 mmol·L-1的Cd2+濃度比較敏感，并且轉基因種子萌發率均高于野生型。脅迫條件下種子發芽率可以反應轉基因植株的抗逆性。從圖7可見：處理前，野生型和轉基因擬南芥A1-1和A1-2的種子發芽率差異不顯著，而當Cd2+濃度為1.5和2.0 mmol·L-1時，野生型種子的萌發率分別是18%和11%，而轉基因株系平均發芽率分別為79%和67%，顯著高于野生型（P＜0.005）。

2.4.2 生理指標的測定 超氧化物歧化酶（SOD）是一種清除超氧陰離子自由基的酶。鎘脅迫會引起活性氧在植物中過量積累。從圖8可以看出：野生型擬南芥和轉基因擬南芥在無脅迫處理時SOD酶活性基本一致，野生型擬南芥的SOD活性為405.2×16.67 nkat·g-1，轉基因擬南芥SOD活性平均為421.3× 16.67 nkat·g-1，脅迫處理1,3,6 d后，所有植株的SOD活性均上升，野生型擬南芥中的SOD活性分別上升至483.7，522.8和561.5×16.67 nkat·g-1，分別比處理前上升了19.4%，29%和38.6%，而轉基因擬南芥中SOD酶的活性則上升至565，608.7和666.2×16.67 nkat·g-1，同比上升了34.2%，44.6% 和58.2%。雖然兩者的SOD活性鎘脅迫后都呈增加的趨勢，但轉基因擬南芥的SOD活性增加幅度明顯高于野生型擬南芥，說明SaFer基因表達提高了轉基因擬南芥鐵離子螯合能力，增加SOD活性來清除過氧化物的傷害，進而提高植物對鎘脅迫的耐受能力。當植物受到逆境影響時，細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內的電解質外滲，導致電導率增大，膜透性變化的程度可以反應植物抗逆性的強弱。如圖9所示：在未處理情況下野生型擬南芥電導率為0.086 S·m-1，轉基因擬南芥電導率為0.088 S·m-1，兩者基本相似。脅迫1，3，6 d后，野生型擬南芥葉片電導率分別上升至0.116，0.183和0.245 S·m-1，比處理前分別上升了35.2%，112.9%和185.2%，轉基因擬南芥電導率分別上升至0.01，0.12和0.171 S· m-1，同比分別上升了13.9%，37.9%和94.5%。野生型擬南芥的葉片電導率增加幅度大于轉基因擬南芥。這表明鎘脅迫對轉基因擬南芥葉片的傷害低于野生型擬南芥，從而說明SaFer基因表達增強了轉基因擬南芥對鎘脅迫的抗性。

圖6 不同濃度鎘離子（Cd2+）脅迫下轉基因與野生型擬南芥種子發芽率Figure 6 Germination rate of transgenic and wild type Arabidopsis thliana seeds under the stress of different concentrations Cd2+

圖7 不同濃度鎘離子（Cd2+）脅迫下轉基因與野生型擬南芥種子發芽率Figure 7 Germination of transgenic and wild type Arabidopsis thliana seeds under the stress of Cd2+

圖8 脅迫前后不同擬南芥株系葉片SOD變化Figure 8 SOD activity in Arabidopsis thliana leaf under Cd2+stress

圖9 脅迫前后不同擬南芥株系葉片電導率的變化Figure 9 Conductivity in Arabidopsis thliana leaf under Cd2+stress

3 討論

隨著社會工業化的迅猛發展，含有重金屬的污染物大量排放，嚴重污染生態環境和農田土壤，導致重金屬離子從土壤和水體中進入植物體內，影響了植物的生長發育和產量，并通過食物鏈進入人體，危害健康，如何高效、綠色清除重金屬污染已經成為國內外關注的熱點問題。本研究以超積累植物東南景天耐鎘相關基因SaFer為研究對象，通過生物信息學、熒光定量PCR以及轉基因技術等方面初步分析了SaFer基因功能，為解析SaFer基因在東南景天鎘超積累過程中的作用奠定基礎。

目前在水稻Oryza sativa，蘋果和蘿卜Raphanus sativus等植物的研究中都發現Ferritin基因的表達能夠提高轉基因植物對重金屬的耐受性［21］。本實驗室利用擬南芥花序侵染法將SaFer基因轉到擬南芥中，通過PCR和qRT-PCR證實了該基因已經整合到擬南芥基因組中并能在擬南芥中正常表達。qRT-PCR結果顯示：鎘脅迫處理后，根部中SaFer基因在鎘脅迫12 h后表達量顯著上調，為對照的8.5倍，24 h急劇下降至對照的2倍，后隨脅迫時間延長表達量緩慢上升，推測該基因為中后期響應基因。將轉基因株系和野生型擬南芥種子播種在含有不同鎘離子（Cd2+）濃度處理的培養基中進行脅迫處理，分析發現SaFer基因可以提高轉基因擬南芥的耐鎘能力。Goto等［22］推測可能是因為鐵蛋白不僅能結合植物體內游離的鐵離子，而且能很容易地結合其他重金屬離子，抵御氧化脅迫的引起的傷害。鎘脅迫對擬南芥種子的萌發影響較大，隨著鎘離子（Cd2+）濃度升高，種子發芽率降低，但轉基因擬南芥均高于野生型，并且當鎘離子（Cd2+）濃度大于1.5 mmol·L-1時，萌發率明顯下降。選擇1.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1的鎘離子（Cd2+）濃度處理轉基因和野生型擬南芥種子發芽率，結果顯示：轉基因擬南芥種子的發芽率明顯高于野生型，達到顯著性差異，說明轉SaFer基因擬南芥種子具有較高的耐鎘脅迫能力。環境脅迫會使植物體內積累過量的超氧負離子和過氧化物，這些物質會破壞細胞膜結構，損傷細胞，脅迫處理后轉基因植株的生理生化變化能反應植株抗逆能力的強弱。用2.0 mmol·L-1氯化鎘脅迫轉基因和野生型擬南芥，初步測定擬南芥的生理生化指標，分析結果表明：隨著脅迫時間的延長，鎘對擬南芥的傷害越嚴重。轉基因和野生型擬南芥的超氧化物歧化酶（SOD）活性均隨脅迫時間的延長而增大，但轉基因株系的增長幅度均高于野生型；葉片電導率也隨脅迫時間的延長而增大，但野生型的上升幅度明顯高于轉基因。說明轉基因擬南芥能更多地清除過氧化物的傷害，抵御鎘離子對細胞膜的破壞，從而維持細胞膜結構的完整性，比野生型擬南芥有更高的鎘耐受性，這與秦天才等［23］的分析表現出類似的結果。

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Isolation and expression of a cadmium-resistant gene（SaFer）from Sedum alfredii

ZHAO Ting1,2,3,HAN Xiaojiao2,3,LIU Mingying2,3,QIAO Guirong2,3,JIANG Jing2,3, JIANG Yancheng1,ZHUO Renying2,3
（1.Department of Biology and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,Xinjiang,China;2.The Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyang 311400,Zhejiang,China;3.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China）

Abiotic stress was a Serious problem that affect plants growth and products.In plants,ferritin is a special iron storage protein closely related to stress.A cDNA from the Sedum alfredii cDNA library,designated as SaFer,was isolated and analyzed by homologous analysis and by Real-Time Reverse Transcription-PCR （qRT-PCR）.Then,cadmium-stress experiments were conducted to compare transgenic Arabidopsis thaliana overexpressed SaFer to a wild type.Results showed that SaFer cDNA was 1 117 bp long with an opening reading frame （ORF）of 759 bp.The ORF of SaFer encoded a polypeptide of 252 amino acids with a calculated molecular weight of about 27.8 kDa,and the homologous analysis showed that it was most closely related to ferritin of Malus domestica with 76%identities.The length of the genomic sequence of SaFer was 1 702 bp and contained 7 introns.Expression profiles in roots were analyzed by qRT-PCR and the results showed that the transcription level of SaFer was enhanced after 12 h cadmium stress.Transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing SaFer displayed much higher Cd tolerance than the wild type which was further supported by physio-logical indexes such as SOD activity and electric conductivity.The results showed that SaFer could provide a glimpse into S.alfredii cadmium-tolerance and could contribute to the breeding of cadmium-tolerant plants. ［Ch，9 fig.1 tab.23 ref.］

botany；Sedum alfredii;ferritin;cadmium stress;expression change

S718.3；Q943.2

A

2095-0756（2015）01-0025-08

浙 江 農 林 大 學 學 報，2015，32（1）：25-32

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.004

2014-03-01；

2014-04-14

國家自然科學基金資助項目（31200465）；國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）項目（2013AA102701-3）

趙婷，從事植物分子生物學研究，E-mail:1458373105@qq.com。通信作者：卓仁英，研究員，博士，從事植物抗逆分子生物學研究，E-mail:zhuory@gmail.com；姜彥成，副教授，從事分子生物學研究。E-mail:xjzkjyc@xju.edu.cn