木腐真菌的鑒定及對不同木材的腐朽能力

駱靜怡，傅威銳，潘程遠

木腐真菌的鑒定及對不同木材的腐朽能力

駱靜怡，傅威銳，潘程遠

（浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 臨安311300）

木腐真菌是一類木質纖維素的自然分解者，在生態系統的物質循環中發揮著重要角色。利用真菌子實體、菌落、菌絲體和分生孢子形態，結合內轉錄間隔區（ITS）和26S rDNA D1/D2區域序列，對環境中采集到的木腐真菌進行鑒定，并對分離鑒定到的真菌進行木質素酶和纖維素酶活性分析，以及木材侵染腐朽能力研究。通過鑒定，共分離得到 5種木腐真菌，分別是尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum，毛栓孔菌 Trametes hirsuta，層生鐮刀菌Fusarium proliferatum，裂褶菌Schizophyllum commune和血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus。酶活分析表明：5種真菌均表現出較高的漆酶和錳過氧化物酶活性，但纖維素酶活性則普遍較低或不存在。利用質量損失法分析5種真菌對6種不同木材樣品的生物降解能力，12周腐朽實驗結果表明：毛栓孔菌的木材腐朽能力較強，造成對橡木Quercus mongolica最高的69.16%的質量損失率，而尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌和裂褶菌等的木材腐朽能力較弱，造成木材質量損失率普遍低于3.00%，血紅密孔菌對不同木材的腐朽能力差異較大，可造成41.37%的橡木質量損失率，而對柚木Tectona grandis僅有2.20%。通過分析酶活性和木材腐朽結果可以得出，真菌木質纖維素酶活力和其木材腐朽能力不存在相關性，即較高的酶活力并不代表其具有較強的木材腐朽能力。圖5表2參36

木材科學與技術；木腐真菌；鑒定；木質素酶；纖維素酶；木材腐朽

木腐真菌，即木材腐朽真菌，是一類能降解木質纖維素的生物體，作為生態系統中的分解者，在物質循環方面有著極為重要的作用。在中國，目前已分離鑒定到1 200余種木腐真菌［1-4］。按分類學地位，木腐真菌主要屬于擔子菌亞門 Basidiomycotina非褶菌目 Polyporales子囊菌門 Ascomycota盤菌綱Discomycetes和半知菌類的部分真菌［5］。從木材腐朽類型來看，木腐真菌可分為白腐真菌、褐腐真菌和軟腐真菌，其中，白腐真菌為最主要的木材腐朽菌，約占已知種類的90%［6］。木腐真菌對木材的腐朽，源于其能分泌木質素酶和纖維素酶，將木材細胞壁中的木質纖維素降解成低分子的物質，并攝取這些物質作為養分和能源，供其生長和繁殖。不同種類的木腐真菌，其所分泌酶的種類和活性有所不同。黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium作為一種白腐真菌，其體內具備降解木質纖維素所有的相關基因［7］，但最被人們熟知的是其體內高活性的木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶［8］。同樣作為木質纖維素降解體系中研究較多的云芝栓孔菌Trametes versicolor，其分泌的木質纖維素酶主要是漆酶和錳過氧化物酶［9-10］。正因為不同木腐真菌具有不同的酶系及活力，使得它們對木材的侵染和分解能力各不相同［11-12］。木腐真菌作為自然界的分解者發揮著巨大的作用，但是對于木材的使用，卻造成了巨大的經濟損失。本研究將對原木中采集的木腐真菌進行分離鑒定，測定各種菌種木質素酶（包括漆酶、錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶）和纖維素酶（包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）的活性，同時比較菌種對 6種家居常用木材柚木 Tectona grandis，橡木 Quercus mongolica，菠蘿格 Intsia bijuga，杉木Cunninghamia lanceolata，花旗松Pseudotsuga menziesii和馬尾松Pinus massoniana等的腐朽能力，分析木腐真菌木質纖維素酶酶活與其木材侵染能力的關系，為擴展木腐真菌種質資源、木材保護以及今后木腐真菌的利用提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 菌種采集、分離與保存

2012年12月12日，在浙江省臨安市馬溪木材廠采集木腐真菌子實體，分別裝于1.5 mL離心管中，并拍照記錄。通過組織分離法，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中分離得到5個菌株，編號為MX1，MX2，MX3，MX4和MX5，并保存于浙江農林大學植物保護學科微生物實驗室。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 菌種形態與顯微觀察 挑取PDA上培養的真菌菌絲制作臨時載玻片，滅菌水作為介質，在10× 40倍顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子及厚壁孢子的形態，用DS-Ri1數碼相機（Nikon）進行顯微拍照。MX1菌株的顯微結構為PDA上培養30 d的菌絲體，MX2，MX3，MX4和MX5菌株的顯微結構為PDA上培養8 d的菌絲體。

1.2.2 菌種內轉錄間隔區（ITS）及D1/D2序列分析 分別挑取PDA上培養8 d的MX1，MX2，MX3，MX4和MX5菌絲體，用EZ-10 Spin Column Fungal DNA Isolation Kit（生工生物）提取其基因組DNA，以提取的DNA為模板，用Fungi Identification PCR Kit（TaKaRa）試劑盒聚合酶鏈式反應（PCR）擴增菌絲體基因內轉錄間隔區（ITS）序列和26S rDNA D1/D2區域序列。PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen）回收目的條帶，對回收的DNA片段進行測序。

1.3 粗酶液制備

刮取在PDA上培養14 d后的木腐真菌菌絲，加蒸餾水研磨，將研磨液離心（1 000 r·min-1，10 min，4℃）得到的上清液作為粗酶液。該粗酶液用于測定木質素酶和纖維素酶的活力。

1.4 粗酶液總蛋白質質量分數測定

取上述各種真菌粗酶液用于總蛋白質質量分數測定。運用Bradford原理，使用蛋白質定量檢測試劑盒（生工生物）進行蛋白測定。

1.5 木質素酶活力測定

1.5.1 漆酶 用ABTS（Sigma）的氧化來表示漆酶的活性。其1.0 mL反應體系為：900滋L 0.5 mmol·L-12, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）和0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0），加入100滋L粗酶液，啟動反應，測定反應3 min內420 nm處吸光度的變化［13］。以1 min轉化1滋mol ABTS所需的酶量來表示1個酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.5.2 錳過氧化物酶 在錳和過氧化氫存在下氧化2,6-二甲氧基苯酚（DMP，Sigma）來表示錳過氧化物酶的活性。其1.0 mL反應體系中含100.0 mmol·L-1酒石酸鈉緩沖液（pH 4.5），1.0 mmol·L-1DMP，1.0 mmol·L-1硫酸錳和0.1 mmol·L-1過氧化氫，在加入100滋L粗酶液后啟動反應體系，測定3 min內469 nm處吸光度的變化［14］。以1 min轉化1滋mol DMP所需的酶量來表示1個酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.5.3 木質素過氧化物酶 在過氧化氫存在下氧化藜蘆醇（Sigma）來表示木質素過氧化物酶的活性。其1.0 mL反應體系中含10.0 mmol·L-1酒石酸鈉緩沖液 （pH 3.0），2.0 mmol·L-1藜蘆醇和0.4 mmol·L-1過氧化氫，在加入100滋L粗酶液后啟動反應體系，測定3 min內310 nm處吸光度的變化［14］。以1 min轉化1滋mol藜蘆醇所需的酶量來表示1個酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.6 纖維素酶活力測定

1.6.1 內切葡聚糖酶 以羧甲基纖維素（CMC，Sigma）為底物，反應產生的還原糖來表示內切葡聚糖酶的活性。在50.0 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）配制成的900滋L 1%（w·v-1）羥甲基纖維素（CMC）溶液中加入100滋L粗酶液，于32℃反應30 min，然后在CMC溶液中加入等體積（1.0 mL）的3,5-二硝基水楊酸（DNS試劑），于100℃水浴10 min，再于4℃下保持15 min，最后恢復室溫，測定540 nm下的吸光度［15］。用1 min所產生1滋g還原糖的量來表示1個酶活力單位（滋g·min-1）。

1.6.2 外切葡聚糖酶 以4-nitrophenyl β-D-cellobioside（pNPC,Sigma）氧化成對硝基酚的能力來表示外切葡聚糖酶的活性。在900滋L含10.0 mmol·L-1pNPC和100.0 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中加入100 滋L粗酶液，于50℃水浴反應15 min，測定415 nm處的吸光度［16-17］。用1 min產生1滋mol對硝基酚來表示1個酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.6.3 β-葡萄糖苷酶 以4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside（pNPG,Sigma）氧化成對硝基酚的能力來表示β-葡萄糖苷酶的活性。在900滋L含10.0 mmol·L-1pNPG和100.0 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中加入100滋L粗酶液，于50℃水浴反應15 min，測定415 nm處的吸光度［17］。以1 min產生1滋mol對硝基酚所需的酶量來表示1個酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.7 木材侵染能力測定

在無菌條件下，將上述分離得到的5種木腐真菌分別接種到9 cm的PDA平板培養皿中，接種后置于25℃培養箱中培養8 d，使菌種長滿平板或基本長滿平板。

從臨安市馬溪木材廠取得未經處理的柚木、橡木、菠蘿格、杉木、花旗松和馬尾松等的邊材加工成18 mm×18 mm×3 mm大小樣品，并給每塊木材樣品編號，放入溫度為103℃烘箱中烘干6 h，每塊木材樣品用電子天平稱量（精確到0.001 g）。然后將木材樣品包好在高壓滅菌鍋中滅菌（120℃，20 min）。在無菌條件下，將木塊置于長滿菌絲的平板培養基內，放木材樣品1塊·培養基-1，重復3次·樣品-1，然后將培養皿放入25℃恒溫培養箱中，12周后，取出附帶菌絲體的木塊，除去表面的菌絲，放入103℃烘箱中烘干6 h，稱量。計算木材樣品受菌侵染后的質量損失百分率，以百分數計算表示。計算公式為：試樣質量損失百分率（%）=（W1-W2）÷W1×100%。其中：W1為木塊樣品試驗前的干質量，W2為木塊樣品試驗后的干質量。

1.8 數據分析

木質纖維素酶在5種木腐真菌中的活性差異以及5種木腐真菌對木材侵染能力的差異運用方差進行分析（Newman-Keuls），其顯著水平α=0.05。數據分析所使用的分析軟件為SPSS 16.0（SPSS Inc）。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 MX1菌株 MX1菌株腐生在楊樹儲木上，圖1A為采集地儲木上菌株子實體（箭頭所指），易與物剝離，灰白色，平伏，貼生。圖1B為該菌從子實體上分離純化后，在25℃下培養8 d的菌落，菌絲起初為白色，隨著培養天數的增加，擴散性色素積累，變為紅色至暗紅色。顯微結構觀察到2種分生孢子，大孢子（圖1C實心箭頭）和小孢子（圖1C空心箭頭）。大孢子細長，鐮刀形，有3個隔，大小約為20.0 μm×1.5~2.5 μm；小孢子形態多樣，有卵形、腎形、圓柱形，大小約為2.5~5.0 μm×1.0~1.5 μm。測序結果發現：MX1菌株ITS序列和26S D1/D2區域序列長度分別為544 bp和606 bp（GenBank登錄號分別為KF513162和KF513167），經美國國家生物技術信息中心（NCBI）快速局域序列對位排列算法（BLAST）比對后發現MX1菌株ITS序列與已知尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum ITS序列（GenBank登錄號JF776163）完全一致；MX1菌株D1/D2序列與已知尖孢鐮刀菌D1/D2序列（GenBank登錄號KF181210）完全一致。尖孢鐮刀菌可以產生大孢子、小孢子和厚壁孢子等3種無性分生孢子，大孢子為兩頭尖，大小20~30 μm的鐮刀狀，小孢子為橢圓形，而厚壁孢子一般在黑暗或逆境中才會出現［18］。綜合MX1菌株的子實體、分生孢子種類和形態、ITS序列和26S D1/D2序列比對結果，可以確定MX1菌株為尖孢鐮刀菌。

圖1 尖孢鐮刀菌（MX1）形態學特征Figure 1 Morphological characteristics of Fusarium oxysporum

圖2 毛栓孔菌（MX2）形態學特征Figure 2 Morphological characteristics of Trametes hirsuta

2.1.2 MX2菌株 MX2號菌株腐生在泡桐木原木上，圖2A為采集地原木上菌株子實體（箭頭所指），無柄蓋形，菌蓋扁平，表面白色中帶淺棕黃色，半圓形或扇形，被厚絨毛，有明顯同心環帶。目前，木腐真菌的鑒定大多以子實體形態來進行判定，該菌株的子實體形態與毛栓孔菌子實體形態極為相似［19］。圖2B為該菌在25℃下培養8 d的菌落，菌絲白色，不產生擴散性色素，有嚴重腐爛臭味。隨著培養天數增加，菌絲越來越茂盛，越長越厚，幾十天之后，可形成團塊狀實心菌絲球，并且菌絲體易從培養基上撕落。顯微結構觀察到2種菌絲形態，圖2C中菌絲不分枝，細長，圖2D中菌絲具有鎖狀聯合（圖2D箭頭）。從顯微結構的2種菌絲形態，可以推測MX4號是擔子菌門的真菌。圖2C中不分枝的菌絲為骨架菌絲，圖2D中具有鎖狀聯合的菌絲為生殖菌絲。測序結果發現，MX2菌株ITS序列和26S D1/D2區域序列長度分別為628 bp和645 bp（GenBank登錄號分別為KF513163和KF513168），經NCBI BLAST比對后發現MX2菌株ITS序列與已知毛栓孔菌Trametes hirsuta ITS序列（GenBank登錄號AB733170）相似度達到99%；MX2菌株D1/D2序列與已知毛栓孔菌D1/D2序列（GenBank登錄號AB733343）完全一致。綜合MX2菌株子實體、菌落形態、菌絲顯微結構、ITS序列和26S D1/D2序列比對結果，可以確定MX2菌株為毛栓孔菌。

2.1.3 MX3菌株 MX3號菌株腐生在松木上，圖3A為采集地原木上該菌株子實體（圖3A箭頭所指的白色物質），白色，平伏，貼生。圖3B為該菌在25℃下培養8 d的菌落，菌絲白色，生長茂盛，無腐爛臭味，培養10 d左右，培養基底部可見黃色或紅紫色擴散性色素。顯微結構觀察到2種孢子，分生孢子和厚壁孢子。分生孢子卵形至橢圓形（圖3C實心箭頭），大小為2.0~5.0 μm×0.5~1.5 μm，并且產孢量大；厚壁孢子卵圓形（圖3C空心箭頭），有分隔，大小為8.0~9.0 μm×1.5~4.0 μm。測序結果發現：MX3菌株 ITS序列和 26S D1/D2區域序列長度分別為 558 bp和 606 bp（GenBank登錄號分別為KF513164和KF513169），經NCBI BLAST比對后發現MX3菌株ITS序列與已知層生鐮刀菌Fusarium proliferatum ITS序列（GenBank登錄號HQ380763）完全一致；MX3菌株D1/D2序列與已知層生鐮刀菌D1/D2序列（GenBank登錄號HQ382533）完全一致。該菌株菌落中心紅紫色色素以及小分生孢子形態與層生鐮刀菌的菌落及小孢子描述相似［20］。綜合MX3菌株子實體、菌落形態、分生孢子種類和形態、ITS序列和26S D1/D2序列比對結果，可以確定MX3菌株為層生鐮刀菌。

圖3 層生鐮刀菌（MX3）形態學特征Figure 3 Morphological characteristics of Fusarium proliferatum

圖4 裂褶菌（MX4）形態學特征Figure 4 Morphological characteristics of Schizophyllum commune

2.1.4 MX4菌株 MX4菌株腐生在楊樹原木上。圖4A為采集地原木上菌株子實體（箭頭所指），菌蓋扇形，菌肉白色，此形態與裂褶菌子實體相似［19］。圖4B為該菌在25℃下培養8 d的菌落，菌絲白色，生長茂盛，不易衰老，有腐爛臭味。隨著培養天數增加，菌絲不斷連接與分化，2~3個月后能在培養基上形成黃色、表面裂褶的蘑菇。該菌菌絲顯微結構具有鎖狀聯合（圖4C實心箭頭），且沿著菌絲兩側長有針狀體（圖4C空心箭頭）。從顯微結構的鎖狀聯合特征，可以推測MX4號是擔子菌門的真菌，圖4C中具有鎖狀聯合的菌絲為生殖菌絲。生殖菌絲的鎖狀聯合以及針狀突是裂褶菌菌絲的典型結構［21］，該菌株菌絲均具有這2種形態，可以初步判定其為裂褶菌。測序結果進一步發現，MX4菌株ITS序列和26S D1/D2區域序列長度分別為636 bp和645 bp（GenBank登錄號分別為KF513165和KF513170），經NCBI BLAST比對后發現MX4菌株ITS序列與已知裂褶菌Schizophyllum commune ITS序列（GenBank登錄號JX848644）完全一致；MX4菌株D1/D2序列與已知裂褶菌 D1/D2序列（GenBank登錄號AB428351）完全一致。綜合MX4菌株子實體、菌落形態、菌絲顯微結構、ITS序列和26S D1/D2序列比對結果，可以確定MX4菌株為裂褶菌。

2.1.5 MX5菌株 MX5菌株腐生在松木上。圖5A為采集地原木上該菌株子實體（箭頭所指），菌蓋扇形扁平，菌肉紅色，此形態與血紅密孔菌子實體形態極為相近［19］。圖5B為該菌在25℃培養8 d的菌落，將培養基上白色物質刮下，在顯微結構下觀察，發現只有大量孢子，并沒有菌絲。該菌株菌絲分布在培養基內部，培養基表面無菌絲。圖5C為分生孢子，圓柱形或橢圓形，大小為1.5~2.5 μm×0.5~1.0 μm。測序結果發現，MX5菌株ITS序列和26S D1/D2區域序列長度分別為636 bp和645 bp（GenBank登錄號分別為KF513166和KF513171），經NCBI BLAST比對后發現MX5菌株ITS序列與已知血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus ITS序列（GenBank登錄號HQ891297）完全一致；MX5菌株D1/D2序列與已知血紅密孔菌 D1/D2序列（GenBank登錄號HM595619）完全一致。綜合MX5菌株子實體、菌落形態、分生孢子形態、ITS序列和26S D1/D2序列比對結果，可以確定MX5菌株為血紅密孔菌。

圖5 血紅密孔菌（MX5）形態學特征Figure 5 Morphological characteristics of Pycnoporus sanguineus

2.2 木腐真菌木質纖維素酶活性

由表1可以看出：5種木腐真菌木質纖維素酶活性存在較大差異，其中，木質素酶活性普遍高于纖維素酶活性。漆酶和錳過氧化物酶在5種真菌中均有表達，其中，漆酶在尖孢鐮刀菌和層生鐮刀菌中活性最高，分別達到501.19和295.73 μmol·min-1·g-1；錳過氧化物酶在層生鐮刀菌和血紅密孔菌中活性最高，分別達到247.11和241.39 μmol·min-1·g-1；木質素過氧化物酶僅在裂褶菌中有少量活性，而在其余4種真菌均未檢測到活性（表1）。內切葡聚糖酶分別在毛栓孔菌、層生鐮刀菌和裂褶菌中檢測到活性，其中在毛栓孔菌中活性最高，達到100.38 μg·min-1·g-1；外切葡聚糖酶僅在毛栓孔菌和層生鐮刀菌中有較低活性，而在其余3種真菌中未檢測到活性；β-葡萄糖苷酶除了在尖孢鐮刀菌中未檢測到活性外，其余四種真菌均有活性（表1）。總體而言，毛栓孔菌、層生鐮刀菌、裂褶菌和血紅密孔菌均表現出木質素酶和纖維素酶活性，而尖孢鐮刀菌僅呈現出木質素酶活性。

2.3 木材侵染能力分析

從木材樣品真菌侵染前后質量損失率可以進一步得出（表2），毛栓孔菌對6種木材造成的質量損失均顯著高于其他4種木腐真菌，其中除了對菠蘿格造成2.21%質量損失外，對其他5種木材樣品均造成20.00%以上的質量損失；血紅密孔菌對菠蘿格的侵染能力類似于毛栓孔菌，對橡木和杉木的侵染能力僅次于毛栓孔菌，但顯著強于其他3種真菌，造成的質量損失率分別達到41.37%和14.08%；尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌和裂褶菌對6種木材樣品的侵染能力顯著弱于毛栓孔菌，其造成的木材質量損失率普遍低于3%。

表1 PDA培養14 d后5種木腐真菌木質纖維素酶活性Table 1 Lignocellulolytic activities of Fusarium oxysporum,Trametes hirsute,Fusarium proliferatum,Schizophyllum commune and Pycnoporus sanguineus on PDA after fourteen days

表2 木腐真菌侵染12周后不同木材的質量損失率Table 2 Weight losses of Tectona grandis,Quercus mongolica,Intsia biujga,Cunninghamia lanceolata,Pseudotsuga menziesii and Pinus massoniana after twelve weeks of wood-rotting fungus exposure

3 討論

通過真菌子實體、菌落、菌絲體和分生孢子形態，結合ITS及26s rDNA D1/D2序列，本研究共鑒定出5種真菌，其中3種屬于擔子菌門非褶菌目，分別是毛栓孔菌、裂褶菌和血紅密孔菌；2種屬于子囊菌門鐮刀菌屬，分別是尖孢鐮刀菌和層生鐮刀菌。毛栓孔菌是最常見的一種木材腐朽菌，能腐生在闊葉樹和針葉樹原木上，造成木材白色腐朽［1］。裂褶菌是分布較廣的一種木材腐朽菌，能腐生在闊葉樹儲木上，造成木材白色腐朽［19］。血紅密孔菌能腐生在多種闊葉樹儲木上，造成木材白色腐朽［6］。層生鐮刀菌是糧食作物中常見的病原菌（特別是玉米Zea mays），能產生一系列的真菌毒素，影響糧食生產與安全［22］，但也有研究表明：該菌種是引起中國楊樹Populus濕心材的一種病原真菌［23］，其具備木質素降解能力［24］。尖孢鐮刀菌廣泛存在于土壤中，可侵染植物的一種兼性寄生真菌，能對許多寄主植物造成病害［25］。本研究中的尖孢鐮刀菌雖是從MX1菌株分離所得，但從子實體外觀形態推測，該菌應該只是與子實體菌株共生的一種真菌。

毛栓孔菌普遍用于木質素的降解研究，其體內具備高活性的漆酶，錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶［26］，但也有研究表明，毛栓孔菌體內具備一定的纖維素酶［27］。本研究中分離到的毛栓孔菌具備木質素和纖維素降解相關的酶（除了木質素過氧化物酶），雖然該菌木質纖維素酶活性在5種真菌中不突出，但其對不同木材的侵染腐朽能力顯著強于其余4種真菌，說明該菌適應能力強，能腐朽不同化學成分和結構的木材，能在多種木材上生長。

血紅密孔菌是一種被廣泛用于產漆酶及其應用研究的真菌［28-30］。本研究中分離到的血紅密孔菌也同樣表現出較高的漆酶活性，同時也檢測到錳過氧化物酶和β-葡萄糖苷酶的活性。血紅密孔菌對不同木材具備不同的白色腐朽能力。Pointing等［31］通過12周的木材腐朽實驗表明，血紅密孔菌能分別造成山毛櫸Fagus sylvatica和樟子松Pinus sylvestris 34.9%和19.1%的質量損失。本研究也同樣發現血紅密孔菌對不同木材表現出較強的選擇性侵染腐朽能力，其中對橡木的侵染能力最強，造成質量損失率達到41.37%，而對柚木的侵染能力較弱，只造成2.20%的質量損失。

裂褶菌作為一種白腐真菌，具備降解木材細胞壁中木質纖維素的能力［32］。Asgher等［33］研究發現，S. commune IBL-06具備木質素降解所需的漆酶、錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶，其中錳過氧化物酶活性最高，其次是漆酶。本研究中，錳過氧化物酶、漆酶和木質素過氧化物酶在裂褶菌體內表現出相似的活性。然而，通過基因組測序發現，裂褶菌雖然具有豐富的纖維素酶基因和漆酶編碼基因，但不存在錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶編碼基因，木質素的降解可能主要依靠漆酶或纖維二糖脫氫酶的作用［34］。雖然裂褶菌具有降解木質纖維素相關的酶，但其活性普遍不高，相應地，其對木材的侵染腐朽能力也不強，造成木材質量損失率為0.61%~2.50%。

層生鐮刀菌因能在玉米中分泌伏馬菌素而成名［35］，但對木材腐爛能力的研究則較少。本研究中，層生鐮刀菌雖然具備較高活性的木質纖維素酶活性，但其對不同木材的侵染能力普遍較弱，造成木材質量損失率＜2.00%。尖孢鐮刀菌雖然是一種傳統的植物病原物，但其體內具有木質素降解的相關酶［36］。本研究也表明，尖孢鐮刀菌菌絲體具有漆酶和錳過氧化物酶的活性，但不存在纖維素酶活性，其對木材的侵染腐朽能力也不強。

通常認為，木質纖維素酶活性高的菌株，相應的降解木質素和纖維素的能力也較強。但從本研究木腐真菌的木質纖維素酶活力及其木材腐朽能力的研究中可以發現，木腐真菌表現出的酶活性和對木材的降解能力不能完全對應，較高的木質纖維素酶活力并不代表其具有較強的木材腐朽能力，如層生鐮刀菌；較低的木質纖維素酶活力也不意味著其木材腐朽能力較弱，如毛栓孔菌。可以看出，真菌木質纖維素酶的活性和其木材腐朽能力關系復雜，真菌對木材的腐朽是個復雜的過程，不能僅憑借某些酶的活性而斷言其腐朽能力。

4 結論

木腐真菌既是自然界中木質纖維素的主要分解者，也是影響木材使用壽命的主要因素。本研究通過對木腐真菌鑒定及其體內木質纖維素酶系研究，分析其對6種木材的侵染能力，得出如下結論：①利用真菌形態學以及分子生物學方法鑒定出5種木腐真菌，分別為尖孢鐮刀菌、毛栓孔菌、層生鐮刀菌、裂褶菌和血紅密孔菌。②5種木腐真菌體內表現出不同的木質纖維素酶種類和活性，其中層生鐮刀菌、毛栓孔菌、裂褶菌和血紅密孔菌具備1種或多種木質素酶和纖維素酶，而尖孢鐮刀菌僅能分泌木質素酶。③毛栓孔菌對木材的侵染能力最強，其造成不同木材的質量損失率均在20.00%以上（除菠蘿格2.21%外），血紅密孔菌對不同木材的侵染能力有所差異，其中能造成較高的41.37%橡木質量損失率，也能造成較低的2.20%柚木質量損失率，其余3種真菌對不同木材的侵染能力均不強，造成的質量損失率菌都低于3.00%。④木腐真菌木質纖維素酶與其木材侵染能力不存在正相關，即具有較高或較為豐富木質纖維素酶的木腐真菌不能認定其具有較強的木材侵染能力，反之亦然。

［1］ 戴玉成，徐梅卿，楊忠，等.中國儲木及建筑木材腐朽菌［J］.林業科學研究，2008，21（1）:49-54. DAI Yucheng,XU Meiqing,YANG Zhong,et al.Wood-decaying fungi on timber or wooden constructions in China ［J］.For Res,21（1）:49-54.

［2］ 戴玉成.中國多孔菌名錄［J］.菌物學報，2009，28（3）:315-327. DAI Yucheng.A checklist of polypores in China［J］.Mycosystema,2009,28（3）:315-327.

［3］ DAI Yucheng.A revised checklist of corticioid and hydnoid fungi in China for 2010［J］.Mycoscience,2011,52（1）: 69-79.

［4］ DAI Yucheng.Polypore diversity in China with an annotated checklist of Chinese polypores［J］.Mycoscience,2012,53（1）:49-80.

［5］ 魏玉蓮，戴玉成.木材腐朽菌在森林生態系統中的功能［J］.應用生態學報，2004，15（10）:1935-1938. WEI Yulian,DAI Yucheng.Ecological function of wood-inhabiting fungi in forest ecosystem ［J］.Chin J Appl Ecol, 2004,15（10）:1935-1938.

［6］ 戴玉成.中國儲木及建筑木材腐朽菌圖志［M］.北京：科學出版社，2009：1-214.

［7］ MARTINEZ D,LARRONDO L F,PUTNAM N,et al.Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78［J］.Nat Biotechnol,2004,22（6）:695-700.

［8］ GOLD M H,ALIC M.Molecular biology of the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium［J］. Microbiol Rev,1993,57（3）:-622.

［9］ PAICE M G,REID I D,BOURBONNAIS R,et al.Manganese peroxidase,produced by Trametes versicolor during pulp bleaching,demethylates and delignifies kraft pulp［J］.Appl Environ Microbiol,1993,59（1）:260-265.

［10］ PAZARLIOGLU N K,SARIISIK M,TELEFONCU A.Laccase:production by Trametes versicolor and application to denim washing［J］.Proc Biochem,2005,40（5）:1673-1678.

［11］ MACHUCA A,FERRAZ A.Hydrolytic and oxidative enzymes produced by white-and brown-rot fungi during Eucalyptus grandis decay in solid medium［J］.Enzyme Microbial Technol,2001,29（6/7）:386-391.

［12］ FERRAZ A,CóRDOVA A M,MACHUCA A.Wood biodegradation and enzyme production by Ceriporiopsis subvermispora during solid-state fermentation of Eucalyptus grandis［J］.Enzyme&Microbial Technol,2003,32 （1）:59-65.

［13］ 燕紅，蘇俊，于彩蓮，等.高效木質素降解菌株的分離篩選［J］.浙江大學學報:農業與生命科學版，2011，37 （3）:259-262. YAN Hong,SU Jun,YU Cailian,et al.Isolation and screening of fungal strains with high ligninolytic enzyme activities［J］.J Zhejiang Univ Agric&Life Sci,2011,37（3）:259-262.

［14］ HEINFLING A,MARTíNEZ M J,MARTíNEZ A T,et al.Transformation of industrial dyes by manganese peroxidases from Bjerkandera adusta and Pleurotus eryngii in a manganese-independent reaction［J］.Appl Environ Microbiol, 1998,64（8）:2788-2793.

［15］ ZHOU Jin,WANG Yonghong,CHU Ju,et al.Identification and purification of the main components of cellulases from a mutant strain of Trichoderma viride T 100-14［J］.Bioresour Technol,2008,99（15）:6826-6833.

［16］ GAO Le,WANG Fenghui,GAO Feng,et al.Purification and characterization of a novel cellobiohydrolase （PdCel6A） from Penicillium decumbens JU-A10 for bioethanol production［J］.Bioresour Technol,2011,102（17）: 8339-8342.

［17］ JOO A R,JEYA M,LEE K M,et al.Production and characterization of β-1,4-glucosidase from a strain of Penicillium pinophilum［J］.Proc Biochem,2010,45（6）:851-858.

［18］ OHARA T,TSUGE T.FoSTUA,encoding a basic helix-loop-helix protein,differentially regulates development of three kinds of asexual spores,macroconidia,microconidia,and chlamydospores,in the fungal plant pathogen Fusarium oxysporum［J］.Eukaryotic Cell,2004,13（10）:1412-1422.

［19］ 曾祥謂，崔寶凱，徐梅卿，等.中國儲木及建筑木材腐朽菌［J］.林業科學研究，2008，21（6）:783-791. ZENG Xiangwei,CUI Baokai,XU Meiqing,et al.Wood-decaying fungi on timber or wooden constructions in China ［J］.For Res,2008,21（6）:783-791.

［20］ CHENG Zhongshan,TANG Wencheng,SU Zhijian,et al.Identification of mangrove endophytic fungus 1403 （Fusarium proliferatum） based on morphological and molecular evidence［J］.J For Res,2008,19（3）:219-224.

［21］ ERDMANN S,FREIHORST D,RAUDASKOSKI M,et al.Transcriptome and functional analysis of mating in the basidiomycete Schizophyllum commune［J］.Eukaryotic Cell,2012,11（5）:571-589.

［22］ BACON C W,NELSON P E.Fumonisin production in corn by toxigenic strains of Fusarium moniliforme and Fusarium proliferatum［J］.J Food Prot,1994,57（6）:514-521.

［23］ 晁龍軍，曾大鵬，孫福在，等.引起楊樹濕心材的一種病原真菌——Fusarium proliferatum（Matsushima）Nirenberg［J］.林業科學，1998，34（5）:69-73. CHAO Longjun,ZENG Dapeng,SUN Fuzai,et al.Fusarium proliferatum（Matsushima）Nirenberg:a pathogen causing wetwood in poplar trees［J］.Sci Silv Sin,1998,34（5）:69-73.

［24］ REGALADO V,RODRíGUEZ A,PERESTELO F,et al.Lignin degradation and modification by the soil-inhabiting fungus Fusarium proliferatum［J］.Appl Environ Microbiol,1997,63（9）:3716-3718.

［25］ 劉波，黃俊生，肖榮鳳.尖孢鐮刀菌生物學及其生物防治［M］.北京：科學出版社，2013：1-109.

［26］ VARES T,HATAKKA A.Lignin-degrading activity and ligninolytic enzymes of different white-rot fungi:effects of manganese and malonate［J］.Can J Bot,1997,75（1）:61-71.

［27］ RANA S,TIWARI R,ARORA A,et al.Prospecting Parthenium sp.pretreated with Trametes hirsuta,as a potential bioethanol feedstock［J］.Biocatal Agric Biotechnol,2013,2（2）:152-158.

［28］ POINTING S B,JONES E B G,VRIJMOED L L P.Optimization of laccase production by Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture［J］.Mycologia,2000,92（1）:139-144.

［29］ LU Lei,ZHAO Min,ZHANG Beibei,et al.Purification and characterization of laccase from Pycnoporus sanguineus and decolorization of an anthraquinone dye by the enzyme［J］.Appl Microbiol Biotechnol,2007,74（6）:1232-1239.

［30］ LU Chunxia,WANG Haiyun,LUO Yuanming,et al.An efficient system for pre-delignification of gramineous biofuel feedstock in vitro:application of a laccase from Pycnoporus sanguineus H275［J］.Proc Biochem,2010,45（7）:1141 -1147.

［31］ POINTING S B,PARUNGAO M M,HYDE K D.Production of wood-decay enzymes,mass loss and lignin solubilization in wood by tropical Xylariaceae［J］.Mycol Res,2003,107（2）:231-235.

［32］ SCHMIDT O,LIESE W.Variability of wood degrading enzymes of Schizophyllum commune［J］.Holzforschung,1980, 34（2）:67-72.

［33］ ASGHER M,KAUSAR S,BHATTI H N,et al.Optimization of medium for decolorization of solar golden yellow R direct textile dye by Schizophyllum commune IBL-06［J］.Int Biodeterioration&Biodegradation,2008,61（2）:189-193.

［34］ OHM R A,JONG J F,LUGONES L G,et al.Genome sequence of the model mushroom Schizophyllum commune［J］. Nat Biotechnol,2010,28（9）:957-963.

［35］ ROSS P F,NELSON P E,RICHARD J L,et al.Production of fumonisins by Fusarium moniliforme and Fusarium proliferatum isolates associated with equine leukoencephalomalacia and a pulmonary edema syndrome in swine［J］. Appl Environ Microbiol,1990,56（10）:3225-3226.

［36］ M?NKEMANN H,H?LKER U,H?LKER M.Components of the ligninolytic system of Fusarium oxysporum and Trichoderma atroviride［J］.Fuel Proc Technol,1997,52（1/3）:73-77.

Identification of wood-rotting fungi and their decay capability in six wood species

LUO Jingyi，FU Weirui，PAN Chengyuan
（School of Agricultural and Food Science，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

Wood-rotting fungi，one of the lignocellulose decomposers in nature，play an important role in the material cycle of the ecosystem.In order to clarify the relationship between wood decay capability of fungi and their lignocellulases activity，five kinds of wood-rotting fungi were identified in this study （namely Fusarium oxysporum,Trametes hirsuta,Fusarium proliferatum,Schizophyllum commune,and Pycnoporus sanguineus），based on morphological characteristics of sporophore，colony，mycelium，and conidium，and combined with sequences of internal transcribed spacer （ITS）and 26S rDNA D1/D2.Also，lignases and cellulases activities were determined from the wood-rotting fungi.Biodegradation capability of the fungi to six different species of wood,including oak （Quercus mongolica）,teak （Tectona grandis）,merbau （Intsia biujga）,Chinese fir （Cunninghamia lanceolata）,Douglas fir （Pseudotsuga menziesii）and masson pine （Pinus massoniana）,was evaluated through wood mass losses of pre-and post-treatments.Results showed that for all five species of fungi,laccase and manganese peroxidase exhibited higher activities than cellulases.After 12 weeks of the decay experiment,T.hirsuta caused the most decay with oak （mass loss of 69.16%）.F.oxysporum,F. proliferatum,and S.commune caused less than 3.00%mass loss with all six species of wood;whereas P.sanguineus caused 41.37%mass loss with oak but only 2.20%mass loss with teak.When comparing wood decay capability of fungi and lignocellulases activity，higher lignases and cellulases activity of the fungus did not mean it had higher decay capability on the wood.［Ch，5 fig.2 tab.36 ref.］

wood science and technology；wood-rotting fungi；identification；lignases；cellulases；wood decay

S782.33

A

2095-0756（2015）01-0001-10

浙 江 農 林 大 學 學 報，2015，32（1）：1-10

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.001

2014-02-17；

2014-05-07

國家自然科學基金資助項目（31301923）；浙江農林大學大學生創新創業基金資助項目（201201012）

駱靜怡，從事木腐真菌研究。E-mail:123973358@qq.com。通信作者：潘程遠，副教授，博士，從事木材抗蟲防腐研究。E-mail:cypan@zafu.edu.cn