丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注后炎性因子的影響

陳 歡 任 越 賈萬龍 宋 玉

河北省廊坊長征醫院神經內科(廊坊 065000)

丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注后炎性因子的影響

陳 歡 任 越△賈萬龍 宋 玉

河北省廊坊長征醫院神經內科(廊坊 065000)

目的：研究丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注損傷恢復期炎性因子的影響，探索丹參多酚酸治療腦卒中的相關作用機制。方法：選用健康雄性Wistar大鼠45只，將大鼠隨機分為丹參多酚酸治療組(SAL組)、腦缺血再灌注模型組(IR組)、假手術組(SH組)，采用改良栓線法制作大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)缺血再灌注模型，SAL組于大鼠神經功能評分(mNss)評分后尾靜脈注射(21mg/kg)，1d1次，連續給藥10d，SH組和IR組給予等量生理鹽水注射。實驗結束后分別檢測腦組織及血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量并進行比較。結果：與SH比較，IR組及SAL組大鼠血清及腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明顯升高；經鼠尾靜脈注射干預10d后SAL組大鼠血清炎性因子含量較IR組下降，TNF-α(45.18±8.84 ，58.37±6.92)、IL-1β(723.27±138.41 ，882.54±146.25)、IL-6(51.28±10.43， 78.17±23.42)；經鼠尾靜脈注射干預10d后SAL組大鼠腦組織炎性因子含量較IR組下降，TNF-α(42.26±14.65 ，50.33±17.15)、IL-1β(37.27±11.05，53.76±15.13)、IL-6(46.62±11.43，57.14±16.36)。結論：丹參多酚酸治療能夠減輕腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織炎癥因子反應，減緩再灌注腦損傷。

腦卒中是臨床常見急危重癥，是當前人類致死和致殘的主要疾病，其中約87%的腦卒中患者為腦梗死。在我國，腦卒中已超過心血管疾病成為居民的第一大死因[1]。早期診斷及治療，減少相關神經功能損傷是治療關鍵。中藥丹參提取物丹參多酚酸是水溶性酚酸類化合物制成的粉針劑，臨床治療上廣泛用于治療輕中度腦梗死患者。已有研究證實，丹參多酚酸鹽具有改善內皮功能、促進血管生成、抑制低密度脂蛋白氧化修飾、抗炎、抑制金屬蛋白酶表達等作用[2]。“瀑布效應”是腦梗死炎癥反應的基礎，多為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)等細胞炎性介質失控釋放形成，炎癥因子被證實在調節腦缺血再灌注動物模型的神經損傷和修復中起著重要的作用[3]。關于丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注損傷恢復期炎性因子的影響相關報道少見，本研究針對腦缺血再灌注損傷恢復期炎性因子水平的變化進行研究，現報道如下。

1 材 料 1.1 動 物 Wistar大鼠(清潔級Ⅱ)，雄性，體重200±25g，45只，購于河北省動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。飼養條件：溫度23±2℃、濕度(55±10)%，12/12h 光照與黑暗模式循環，常規攝食，自由飲水，適應性喂養1周后用于實驗。

1.2 材料及儀器 注射用丹參多酚酸(SLI，國藥準字Z20110011，0.1g)；LGR10-4.2型離心機(北京市醫用離心機廠)；MCAO栓線(北京沙東生物技術有限公司 AAAA 級)；Rat TNF-α ELISA Kit、Rat IL-1β ELISA Kit、Rat IL-6 ELISA Kit 試劑盒(美國RayBiotech, Inc)；antibody to IL-1β(美國RayBiotech,Inc)；antibody to TNF-α、antibody to IL-6(英國Abcam公司)。

2 方 法 2.1 分組及模型建立 大鼠常規飼養1周后，采用隨機數字表法將實驗用45只Wistar大鼠隨機分為3組：丹參多酚酸治療組(SAL組)、腦缺血再灌注模型組(IR組)、假手術組(SH組)。腦缺血再灌注模型組(IR組)采用Longa等改良栓線法制作：準備無菌手術器械，手術間常規紫外線殺菌，大鼠術前12h禁食，自由飲水，大鼠稱重后，戊巴比妥鈉50mg/kg經腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定于鼠板，胸前區剃毛，充分暴露頸部，碘伏消毒，取頸部正中縱行切口，依次剪開皮膚、筋膜，鈍性分離頸前肌群，暴露右側頸總動脈，神經剝離器分離迷走神經、右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，動脈鉗暫時夾閉右側頸總動脈，結扎頸外動脈遠心端，于殘端插入直徑0.26mm的栓線，經頸內動脈至大腦中動脈(MCA)起始處，進線深度約17～18mm。阻斷血流2h后緩慢拔出栓線恢復血流再通。術畢逐層縫合各層組織。腹腔一次性注射青霉素10萬單位抗感染治療。術后備足飲水，大鼠單籠飼養至完全清醒。丹參多酚酸治療組(SAL組)術式同IR組。假手術組(SH組)大鼠不使用栓線阻斷大腦中動脈血流，余手術過程同IR組大鼠。大鼠清醒后通過mNSS 評分法評價大鼠神經功能，滿分18分，進行運動、感覺、反射和平衡木4項測試。mNSS評分在7～12分者考慮造模成功，可納入IR及SAL組，評分<7分、>12分及合并癲癇發作或術中出現嚴重損傷不符合實驗要求大鼠予以剔除，SAL組、IR組、SH組大鼠分別剔除4只、3只、1只。

2.2 給藥方法 于術后3h大鼠完全清醒mNss評分后，SAL組大鼠通過尾靜脈注射丹參多酚酸(21mg/kg)，1d1次，連續給藥10d。IR組及SH組大鼠通過鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，1d1次。

2.3 指標檢測及方法 實驗結束后使用戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，開胸后左心室采血約4mL，常溫狀態留置30min，低溫離心機1000r/min離心20min，取上層血清裝于清潔EP管中，貯存于-80℃低溫冰箱中備檢。ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，嚴格按RayBiotech, Inc公司試劑盒說明書逐步操作。心室采血后迅速將8號針頭插入左心室，同時剪開右心耳部觀察流出液體顏色，4℃預冷生理鹽水灌洗100mL到150mL見右心耳流出液體顏色清亮后，使用4%多聚甲醛250mL進行灌注固定。大鼠周身僵硬后即迅速開顱以取出腦組織，放置4%多聚甲醛液中固定12h以上，取大鼠腦冠狀位前囟-2.0～+2.0mm梗死中心區組織，切成厚度2mm組織切片，然后進行脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋等步驟，制成大鼠腦組織蠟塊，保存在4℃冰箱中備檢。免疫組化檢測腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.4 統計學方法 有關實驗數據以均數±標準差表示。多組均數間比較，采用One-way ANOVA 檢驗，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。P<0.05為差異有統計學意義，使用SPSS 16.0 統計軟件處理分析。

3 結 果 3.1 治療后各組大鼠血清炎性因子指標比較 見表1，與SH比較，IR組及SAL組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明顯升高，提示制模成功；經鼠尾靜脈注射干預10d后SAL組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量較IR組下降(P<0.05)。

表1 治療10d后各組大鼠血清炎性因子指標比較

3.2 治療后各組大鼠腦組織炎性因子含量比較 見表2，與SH比較，IR組及SAL組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明顯升高，提示制模成功；經鼠尾靜脈注射干預10d后SAL組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量較IR組下降(P<0.05)。

表2 治療10d后大鼠腦組織炎性因子濃度比較(個

4 討 論 腦缺血性損傷后大腦神經膠質細胞被激活，外周血液系統中白細胞即開始向中樞神經系統聚集浸潤，并開始釋放大量的炎性因子、蛋白水解酶、氧自由基等損傷神經系統內皮細胞，導致血腦屏障破壞、神經細胞凋亡壞死，引發炎性的級聯反應，這些因素共同作用下，促進腦缺血性損傷進一步加重，使病情進展惡化[4]。大腦中動脈栓塞(MCAO)模型大鼠是研究腦缺血損傷最經典的動物模型。缺血腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6主要由神經元和小膠質細胞分泌，TNF-α、IL-1β、IL-6 等細胞炎性介質是導致炎性因子“瀑布效應”的關鍵。如何減輕炎性因子導致的“瀑布效應”是挽救腦缺血性梗死細胞幷改善臨床癥狀的基礎。

丹參多酚酸鹽是從傳統中藥丹參中提取的，主要成分以丹參乙酸鎂為主的丹參多酚酸鹽混合物，其治療功能主要是活血化瘀，同時具有改善微循環、抗炎、抗栓、抗氧化、清除自由基、抑制內皮素釋放、改善器官缺血再灌注損傷等作用，藥理機制為分子及細胞水平上多環節、多靶點作用的特點[5]。陳昕琳[6]研究顯示丹參多酚酸B可能通過調節OX40/OX40L信號通路抑制動脈粥樣硬化炎癥免疫反應，達到抑制動脈粥樣硬化的進程。Meta分析顯示注射用丹參多酚酸鹽對缺血性腦卒中患者有更好的治愈率，且能提高血管內皮細胞保護功能，改善血液流變學參數[7]。

本研究顯示，實驗結束后測定腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較假手術組升高，提示本實驗動物模型制作成功。經注射用丹參多酚酸通過鼠尾靜脈注射治療腦缺血再灌注損傷模型大鼠10d后，與缺血再灌注組大鼠比較，SAL組大鼠血清及腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯下降。既往研究顯示，動物實驗發現丹參多酚酸鹽治療能明顯改善大鼠腦局部缺血后腦梗死面積，對缺血再灌注全腦損傷有明顯保護作用，并可明顯延長低壓力缺氧小鼠的生存時間。本研究結果進一步證實丹參多酚酸治療減輕了炎癥因子反應，起到了缺血再灌注腦損傷的保護作用，為臨床治療腦梗死患者用藥提供了實驗證據。

綜上所述，丹參多酚酸治療能夠減輕腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織炎癥因子反應，起到了缺血再灌注腦損傷的保護作用。對于不同時間點丹參多酚酸治療大鼠腦缺血再灌注損傷的治療效果及炎癥因子水平變化有待于進一步研究。

[1] Liu L,Wang D,Wong KS,et al.Stroke and stroke care in China: huge burden, significant workload, and a national priority[J].Stroke,2011,42(12):3651-3654.

[2] 高 潔,盛 嬰,金愛萍,等.注射用丹參多酚酸鹽對兔主動脈粥樣硬化程度的影響[J].陜西醫學雜志,2014,43(5):529-530,603．

[3] Jafarinaveh HR,Allahtavakoli M,Rezazadeh H,et al.Proinflammatory cytokines in the embolic model of cerebral ischemia in rat[J].Iran J Allergy Asthma Immunol,2014,13(2):125-130.

[4] Jin R,Yang G,Li G.Inflammatory mechanisms in ischemic stroke:role of inflammatory cells[J].J Leukoc Biol,2010,87(5):779-789.

[5] 張曉雷,陳俊華,郭春霞,等.丹參多酚酸鹽的藥理作用研究[J].世界臨床藥物,2013,34(5):292-297.

[6] 陳昕琳,章怡祎,顧仁樾,等.丹參多酚酸B對動脈粥樣硬化大鼠OX40/OX40L免疫通路研究[J].陜西中醫,2012,33(6):758-761．

[7] 曾 明,邸曉輝,王金萍.注射用丹參多酚酸鹽治療缺血性腦卒中療效與安全性的系統評價[J].中國實驗方劑學雜志,2015,21(5):225-229．

(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

腦缺血 @丹參多酚酸 大鼠，wistar

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.059

△通訊作者：河北省保定市第五醫院麻醉科(保定 071000)