正交試驗優(yōu)化桃仁油中脂肪酸類分離純化工藝*

劉 清 顏永剛 王紅艷 衛(wèi) 昊

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

·方藥縱橫·

正交試驗優(yōu)化桃仁油中脂肪酸類分離純化工藝*

劉 清 顏永剛△王紅艷 衛(wèi) 昊

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

目的: 篩選桃仁油中脂肪酸類化學(xué)成分分離純化的最佳工藝。方法: 以UV法測定桃仁油中脂肪酸類成分含量為指標(biāo),選用不同的填料LS-106大孔樹脂和硅膠，不同柱徑比，不同樣品濃度、不同洗脫速度對桃仁油中脂肪酸類化學(xué)成分得率的影響， 洗脫劑石油醚：丙酮比例依次為85∶15，87.5∶12.5，90∶10。用正交試驗設(shè)計法對純化工藝進行分析。結(jié)果: 本實驗以桃仁脂肪酸含量作為篩選填料的評價指標(biāo)，比較了三種因素影響下LS-106大孔樹脂及硅膠對桃仁脂肪酸的分離純化性能，硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，用A3B3C2條件作為桃仁脂肪酸的最佳分離純化工藝。結(jié)論: 驗證試驗結(jié)果表明該方法具有可操作性、準(zhǔn)確、簡便、靈敏、穩(wěn)定性強、重現(xiàn)性好。硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，在A3B3C2條件下用于桃仁油中脂肪酸類物質(zhì)的分離純化。

桃仁來源于薔薇科(Rosaceae)植物桃Prunuspersica(L)Batsch.或山桃Prunusdaridiana(Carr.)Franch.的干燥成熟種子，性味苦、甘，平，具有活血化瘀、潤腸通便的功效,用于經(jīng)閉，痛經(jīng)，癥瘕痞塊，跌撲損傷，腸燥便秘[1-2]。在血府逐瘀湯(《醫(yī)林改錯》)、生化湯(《傅青主女科》)、桂枝茯苓丸(《金匱要略》)、桃核承氣湯(《傷寒論》)等醫(yī)家名方中均重用桃仁，現(xiàn)代研究亦表明桃仁對心腦血管疾病療效顯著，近年來受到廣泛關(guān)注[3]。在前期工作的基礎(chǔ)上，本實驗采用LS-106樹脂及硅膠對桃仁油中的脂肪酸類成分進行純化，以便得到純度高的組分，為進一步篩選桃仁活血化瘀的活性組分提供了藥效研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥 UV-2500紫外可見分光光度儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，GB204型電子天平(德國賽多利斯公司),LS-106大孔吸附樹脂、柱層析硅膠(200-300目)，亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號111622-200602,)，95%乙醇、石油醚(600C-900C)、甲醇、丙酮、無水乙醇、硫酸、香草醛等均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果 2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 取亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品進行紫外掃描，確定最大波長為269nm。精密稱取亞油酸對照品50μL,用甲醇溶解并定容至50mL，濃度為1.16mg/mL,分別精確取1、2、3、4、5mL置10mL容量瓶中,甲醇定容。采用紫外分光光度法，以吸光度A對濃度C做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為C=1.66174A～0.12370,r=0.9996。

2.2 純化試驗設(shè)計 本實驗以桃仁油中脂肪酸類含量為指標(biāo),考察不同柱徑比，樣品濃度、洗脫速度對桃仁得率的影響， 洗脫劑石油醚：丙酮比例依次為85∶15，87.5∶12.5，90∶10。用正交試驗設(shè)計法對純化工藝進行分析,因素水平見表1。

表1 純化工藝因素水平表

2.3 樣品液中亞油酸的含量測定 2.3.1 上樣液的制備：取桃仁油3mL,分別將1mL定容至5mL，1mL定容至10mL，1mL定容至15mL，制成濃度0.2mL/mL、0.1mL/mL、0.067mL/mL，作為上樣液。

2.3.2 柱層析分離：將各樣品液加到已處理好的大孔吸附樹脂柱中,靜置30min后,依次用石油醚與丙酮800mL(85∶15，87.5∶12.5，90∶10)梯度洗脫,選擇洗脫液流速、每50mL為1份,分段收集,得到大孔吸附樹脂分離樣品。同法用硅膠作為層析柱填料，在相同條件下洗脫得到硅膠分離樣品。

2.3.3 點樣結(jié)果分析：用毛細(xì)管分別吸取減壓濃縮后純度較高的桃仁油溶液和亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品各5μL在硅膠G薄層上點樣，展開劑為石油醚-丙酮體系(85∶15至90∶10)，用5%香草醛-硫酸乙醇溶液在105℃條件下顯色，測定Rf值。合并洗脫液，水浴揮干洗脫溶劑，得到純度較高的桃仁油，用甲醇定容至10mL,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定各個樣品中亞油酸的含量。

2.4 純化實驗結(jié)果 硅膠純化樣品相對含量結(jié)果見表2，大孔吸附樹脂純化樣品相對含量結(jié)果見表3，兩種固定相不同梯度洗脫所測各有效組分相對百分含量結(jié)果見表4、5。硅膠純化工藝顯示，徑柱比和樣品濃度對有效成分含量具顯著性影響，流速影響不大。大孔吸附樹脂純化工藝顯示，徑柱比和樣品濃度對有效成分含量具顯著性影響，流速影響不大。試驗因素的主次順序為柱徑比>樣品濃度>流速,最優(yōu)水平為A3B3C2。方差分析說明柱徑比對試驗影響差異達到顯著水平。對三個洗脫梯度進行比較可以看出石油醚：丙酮(85∶15)有效組分相對百分含量較高。

表2 硅膠純化工藝正交實驗方案和結(jié)果

表3 大孔吸附樹脂純化工藝正交實驗方案和結(jié)果

表4 硅膠不同梯度洗脫所測含量

表5 大孔吸附樹脂不同梯度洗脫所測含量(%，n=9)

2.5 驗證試驗 精確取桃仁油1mL,定容至15mL制成樣品液,經(jīng)薄層鑒定后合并的樣品揮干溶劑,用甲醇定容至10mL,按上述方法測定亞油酸的含量。根據(jù)A3B3C2,石油醚：丙酮在(85∶15至90∶10)的條件做平行實驗。結(jié)果脂肪酸含量用樹脂柱純化或者用硅膠柱純化，其含量均在95%以上，表明該方法可操作性強、重現(xiàn)性好。其中以硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，優(yōu)選在A3B3C2條件下進行桃仁脂肪酸的純化。

2.6 桃仁油中脂肪酸類的分離純化 由于大量粗桃仁油樣品通過樹脂柱時玻璃柱出現(xiàn)爆裂，分析原因可能是由于溶劑極性差異較大，在樹脂柱內(nèi)產(chǎn)生放熱過程，因此用硅膠柱對桃仁油進行純化分離。利用正交試驗所確定的實驗結(jié)果大量提取粗桃仁油100mL，分兩次進行純化分離，50mL桃仁油用石油醚稀釋到125mL，層析柱用200～300目的層析硅膠干法填柱，柱徑比為1∶12，用石油醚浸透硅膠，將上樣液緩緩加入硅膠柱，流動相用石油醚與丙酮梯度洗脫，石油醚：丙酮比例為99∶1至50∶50，每2.5個單位等度遞減，進行洗脫，濃縮不同的洗脫液，通過薄層色譜鑒定，合并洗脫液，得到純度較高的桃仁油。

3 討 論 桃仁在提取、分離時避免溫度過高，否則會破壞藥材的部分化學(xué)成分。用非極性溶劑石油醚萃取時，盡量萃取完全，否則桃仁脂肪酸的產(chǎn)率將會降低。桃仁提取物在柱層析分離過程中，層析柱分離樣品的量和填料的量都要明確，填料后要考慮柱徑比，以保證樣品有良好的分離效果。梯度洗脫過程中樣品餾分的范圍要小，薄層分析檢測后要準(zhǔn)確、及時的合并樣品，并做好標(biāo)記和記錄。本實驗以桃仁脂肪酸含量作為篩選填料的評價指標(biāo)，比較了三種因素影響下LS-106大孔樹脂及硅膠對桃仁脂肪酸的分離純化性能，硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，故優(yōu)選A3B3C2條件作為桃仁脂肪酸的純化工藝。

[1] 中國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:260.

[2] 張廷模．中藥學(xué)[M]．高等教育出版社，2002．265．

[3] 裴 瑾，顏永剛,萬德光.桃仁油對動物血液流變學(xué)及微循環(huán)的影響[J].中成藥,2011,33(4):587-589.

(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

*國家自然科學(xué)基金(30901970)

桃仁 正交試驗 脂肪酸類 @分離純化

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.049

陜西省教育廳專項科研計劃項目(14JK1204)

△通訊作者