腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清對骨髓間充質干細胞分泌腎臟保護性生長因子的作用

張曉鳳 樊 平 田 耘 陜西省中醫醫院腎病科(西安 710003)

腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清對骨髓間充質干細胞分泌腎臟保護性生長因子的作用

張曉鳳 樊 平 田 耘 陜西省中醫醫院腎病科(西安 710003)

目的：探討腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清對大鼠MSCs分泌腎臟保護性生長因子HGF、BMP-7的作用。方法：灌胃法制備腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清。采用密度梯度離心法分離和培養大鼠MSCs，取第三代MSCs，分別加入腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清和對照血清體外對MSCs進行培養，至第10d，應用RT-PCR法檢測兩組MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表達情況進行比較。結果：培養10d后，腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清組培養的MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表達高于對照組。結論：腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清可上調MSCs分泌腎臟保護性生長因子HGF、BMP-7的表達，從而對腎間質纖維化發揮修復作用。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新、多系分化和高度增殖的細胞，易于分離培養、擴增，移植時不存在組織配型、免疫排斥及倫理等問題，日益成為細胞移植和組織工程中的理想種子細胞[1]。MSCs以旁分泌方式分泌多種細胞因子和生長因子，促進周圍細胞的存活，完成腎小管修復是其發揮腎間質纖維化治療的主要機制[2]。MSCs的這種旁分泌作用與中藥復方配伍治療疾病的作用機制非常相似。有研究報道某些益氣活血降濁的中藥復方和溫陽補腎的中藥單體具有體外促進MSCs分泌細胞因子的作用[3, 4]。益腎散結法是中醫治療慢性腎臟病的常用法則, 基于此法則研制的中藥復方腎復康Ⅱ號膠囊是治療腎間質纖維化的有效方劑[5]。既往研究表明，腎復康Ⅱ號膠囊可減少腎臟局部轉化生長因子β 1(transforming growth factorβ 1，TGF-β1) 和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor1，PAI-1)的表達。本此利用含藥血清技術研究腎復康Ⅱ號膠囊是否具有體外促進MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用，從而探討益腎散結法與MSCs旁分泌HGF、BMP-7，促進腎小管修復之間的關系, 為中醫益腎散結法治療腎間質纖維化提供新的理論依據。

1 實驗材料 1.1 材 料 主要儀器與試劑：醫用超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)，CO2恒溫培養箱(德國HERA cell公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，數顯恒溫水浴鍋(上海躍進醫療器械公司)，DMEM / F12 1∶1培養基(美國Hyclone公司)，優質胎牛血清(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶消化液(美國Sigmar公司)，青霉素和鏈霉素(美國Hyclone公司)，Real-time PCR 儀(美國,Applied Biosystems 7000)，穩壓穩流電泳儀。

1.2 實驗動物 MSCs取自于2周齡雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓中，經體外分離、擴增培養。Sprague-Dawley 大鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.3 藥 物 腎復康Ⅱ號膠囊(菟絲子、丹參、王不留行、鱉甲、僵蠶、山萸肉各12g，金櫻子、淫羊藿、炒杜仲、姜黃、莪術、赤芍各10g)，由陜西省中醫醫院藥劑科提供。

2 實驗方法 2.1 分 組 Wistar大鼠20只, 分為兩組, 腎復康Ⅱ號膠囊組和生理鹽水對照組, 分別灌服腎復康Ⅱ號膠囊溶液(450mg/kg·d)及等體積的生理鹽水，1次/d, 連續10d。

2.2 含藥血清及對照血清的制備 兩組大鼠于末次給藥后1h開胸心尖取血, 2500rpm離心25min，分離血清, 經56℃，30min滅活, 0.22μm濾膜過濾滅菌, -30℃保存備用。

2.3 MSCs的分離、純化和培養 取2周齡雄性SD大鼠兩只，頸椎脫臼法處死，浸泡于75%乙醇中15min后，置于超凈臺中；嚴格無菌條件下將大鼠下肢皮膚去除，股骨于髖臼處離斷，置于無菌培養皿中。剪除軟組織，剔除股部和腿部肌肉后分離出雙側股骨及脛骨；將分離的股骨和脛骨放于滅菌PBS中，浸泡5min。剪斷股骨、脛骨兩端骨骺露出骨髓腔，用5mL注射器吸引無血清的培養基，沖出骨髓組織，反復數次，至骨髓腔發白，1000rpm，離心5min，棄上清；在細胞沉淀中加入含10%FBS，1%青、鏈霉素的L-DMEM培養基，充分吹打制成單細胞懸液。細胞計數后，調細胞濃度以2×106/cm2的密度接種于25cm2的塑料培養瓶，置于37℃、5 %CO2飽和度的恒溫培養箱中培養；接種24h后，首次半量換液，之后每3d換液1次。7～10d后待細胞融合達80%時，進行傳代。傳代過程如下：棄去培養液后，以37℃預熱的PBS輕洗兩次，加入含0.25%胰酶的消化液1mL，消化2min后，在倒置顯微鏡下觀察到細胞皺縮變圓部分脫壁后，終止消化。輕吹打細胞后收集，1000rpm，離心5min，棄上清；加入10mL含15%FBS的培養基重懸，并以1∶2比例分瓶，即為第1代MSCs (passage 1)，記為P1，將培養瓶置于恒溫培養箱中培養。4～5d后待細胞長滿80%時，按以上步驟進一步培養傳代。

2.4 含藥血清對MSCs的體外旁分泌作用 將待處理的MSCs分別移至放有無菌蓋玻片的6孔板中培養成單層，再分別加入腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清及對照血清，每隔48h換液。于第10d作以下檢測：應用RT-PCR法檢測腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清對MSCs分泌HGF、BMP-7的表達。收集血清處理后的各組細胞，加入1mL Trizol 提取總 RNA，紫光分光光度儀測定其純度和含量，凝膠電泳檢測其完整性。合成的引物序列如下：HGF上游引物5AAGAGTGGCATCAAGTGCCAG-3’,下游引物，5’-CTGGATTGCTTGTGAAACACC-3’；BMP-7上游引物，5’-CTCCACAGGTAGCACACATCAC -3’，下游引物，5’-CCACATCCAGAACCAGAGACTT-3’；GAPDH上游引物, 5’-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物，5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’。總RNA樣品用隨機引物按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說明合成cDNA 第一鏈，利用Primer-Express (ABI, Foster City, CA)設計引物，以其為模板應用Prism 7500 real-timePCR 儀進行實時PCR 反應。所用熒光試劑為SYBR-Green，逆轉錄cDNA 樣品擴增至反應結束。然后以GAPDH 作為標準測定Ct(cycle threshold)值。以目的基因/GAPDH的比值衡量PCR反應產物。

3 結 果 3.1 MSCs的分離、純化和培養 原代培養的MSCs 24h后開始貼壁，形態不均一，體積較小，或圓形，或多邊形，或梭形，3d后可形成集落(圖1-1)；7d時細胞呈長梭形。細胞融合達80%時，即可進行傳代。傳代后的MSCs增殖速度明顯加快，細胞形態基本均一，呈紡錘形或長梭形，鋪展狀，活力好，可見少量未貼壁的雜細胞。通常情況下，MSCs每5～7d傳代一次，通過換液和傳代的方法可以純化細胞。第3代MSCs形態均勻呈成纖維細胞樣，旋渦狀分布(圖1)。

A：為P0代MSCs，可見細胞形態各異，B：為P3代MSCs，可見細胞形態均一，成旋渦狀分布

圖1 MSCs形態圖

3.2 RT-PCR檢測腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清對MSCs分泌HGF、BMP-7的作用 腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清組和生理鹽水對照血清組分別培養細胞10d后，經PCR法檢測，腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清具有促進MSCs分泌抗纖維化因子的作用，藥物作用后的MSCs 分泌的HGF、BMP-7 等細胞因子表達明顯上調，組間比較具有統計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 MSCs的HGF、BMP-7 mRNA的表達

組別HGF/GAPDHBMP-7/GAPDH對照組0.137±0.0050.271±0.010實驗組0.550±0.056△1.506±0.118△

注：與對照組比較，△P<0.05

4 討 論 中醫益腎、散結治則是用于治療慢性腎臟病的常用法則, 旨在疏通病變部位的脈絡, 改善局部生存狀態, 與促進其分泌HGF、BMP-7，參與局部微環境的重建有相通之處。基于此法則而研制的腎復康Ⅱ號膠囊是臨床治療腎間質纖維化的有效方劑。本研究發現體外培養的MSCs在腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清的誘導下，分泌抗纖維化因子HGF、BMP-7的作用明顯增強。HGF、BMP-7可與受損腎臟中的某些細胞因子結合刺激腎組織原位干細胞和殘余腎小管上皮細胞完成腎小管修復作用。因此，我們認為，腎復康Ⅱ號膠囊含藥血清具有體外誘導MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用，為將來協助MSCs移植治療腎間質纖維化提供了可靠的手段和理論依據。

[1] Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL,et al. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow[J]. Stem cells (Dayton, Ohio), 2002, 20(3): 249-58.

[2] Cheng K, Rai P, Plagov A, et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms [J]. Exp Mol Pathol, 2013, 94(3): 466-73.

[3] 晏子友, 趙 海, 賴小美. 腎衰泄濁湯對腎間質纖維化小鼠HGF、TGFβ-1的調節作用[J]. 中國中醫藥科技,2007,14(2): 74-75.

[4] 裴志勇, 趙玉生, 高 偉,等. 地黃低聚糖對人脂肪組織來源干細胞旁分泌作用的影響[J]. 中國臨床保健雜志,2012,10(4): 388-391.

[5] 史 健, 劉建紅, 程小紅,等. 腎復康Ⅱ號對大鼠腎間質纖維化及轉化生長因子-β1的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2012,28(3): 99-101.

(收稿2014-11-01；修回2014-11-20)

血管性頭痛/中醫藥療法 @葛根通絡湯

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10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.060