硝菔通結方對功能性便秘大鼠腸神經遞質的影響*

王郁金 周永學△◇ 張 紅 閆曙光 謝 培 滿思藝 成都中醫藥大學(成都610072)

·實驗研究·

硝菔通結方對功能性便秘大鼠腸神經遞質的影響*

王郁金▲周永學△▲◇張 紅▲閆曙光▲謝 培▲滿思藝▲成都中醫藥大學(成都610072)

目的：探討硝菔通結方對功能性便秘大鼠腸神經遞質 SP、NO、5-HT、VIP表達的影響。方法：成年SD雄性大鼠50只，隨機分為空白對照組、模型組、硝菔通結方高、中、低劑量組，每組各10只。采用復方地芬諾酯灌胃建立SD大鼠功能性便秘模型，造模成功后治療組給予不同劑量硝菔通結方灌胃。觀察各組大鼠一般表現，首粒黑便排出時間，Elisa檢測大鼠血清中SP、NO、 5-HT，Q-PCR檢測結腸組織中VIP mRNA的水平。結果：與空白組比較，模型組大鼠糞便量少,首粒黑便排出時間明顯延長；血清中SP水平明顯降低，NO、5-HT水平明顯升高；結腸組織中VIP mRNA水平降低。與模型組比較，硝菔通結方各劑量組大鼠糞便量增加，首粒黑便時間縮短；血清中SP水平升高，NO、5-HT水平降低；結腸組織中VIP mRNA水平升高。大劑量組變化最為明顯。結論：大鼠便秘的發生可能與腸神經遞質異常表達有關，硝菔通結方治療功能性便秘的機制可能是通過改變相關腸神經遞質SP、NO、5-HP、VIP的表達來實現。

功能性便秘是常見的胃腸疾病，其發病率高，危害面廣，嚴重影響患者的生活質量。便秘患者大多自行購買刺激性瀉藥,長期服用造成“瀉劑結腸”。硝菔通結方是周永學教授前期臨床和實驗研究的治療便秘的主方，且其不含蒽醌類成分。因此我們進一步研究該方對功能性便秘大鼠腸神經遞質的影響，明確其治療功能性便秘的作用機制，為藥物的開發奠定基礎。

1 實驗動物及藥品 1.1 實驗動物 SD大鼠， 50只，體重200g左右，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心，許可證號SCXK(陜)2012-003。

1.2 實驗藥物 硝菔通結方(肉蓯蓉、當歸各15g,芒硝30g,鮮萊菔1000g)；水煎并濃縮。復方地芬諾酯片：江蘇常州康普藥業有限公司。

1.3 實驗試劑與儀器 大鼠SP、NO、5-HT Elisa檢測試劑盒：上海西唐生物技術有限公司，EasyPure RNA Kit、 CDNA合成試劑盒、Q-PCR試劑盒：北京全式金生物技術有限公司，VIP引物的設計與合成：南京金斯瑞生物科技有限公司。酶標儀：ELX808，美國Bio-Tek公司，離心機:KDC-40低速離心機，PCR儀EDC-810型高速分散器(內切式勻漿機)：XHF-D，寧波新芝生物科技股份有限公司，電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9140A型。

2 實驗方法 2.1 動物分組 SD大鼠，隨機分為空白組、功能性便秘模型組、硝菔通結方高(380g/kg)、中(190g/kg)、低(95g/kg)劑量組，每組10只。

2.2 動物模型的制備 根據文獻和前期預實驗摸索的方法和劑量，以復方地芬諾酯灌胃10mL/kg體積(15mg/kgmL濃度)，觀察大鼠的一般狀態，大鼠進食量，大便量和大便質地確定模型制備成功。

2.3 動物給藥 大鼠造模成功后，治療組以制備好的硝菔通結方水煎液進行灌胃?？瞻捉M以予同體積生理鹽水；共給藥4周。

2.4 檢測指標 一般行為學:觀察每日觀察動物一般行為表現及排便情況。

首粒黑便觀測采用活性炭灌胃法測定首粒黑便時間，觀察腸道傳輸功能，硝菔通結方治療后，每組隨機挑取5只大鼠，單只放于大鼠代謝籠內，以活性炭灌灌胃，記錄首粒黑便排出時間。

血清SP、 NO、 5-HT檢測 給藥結束后，動物用10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血取血，離心，分離血清，檢測大鼠血清中SP、 NO、 5-HT的含量。給藥后，取各組大鼠相應部位1cm結腸組織，生理鹽水沖洗，放入有RNA保護液的無菌EP管中，迅速保存至-80℃冰箱備用。組織勻漿，按RNA提取試劑盒提取總RNA。按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA，測cDNA濃度。Q-PCR法檢測mRNA表達，引物序列如下：上游引物：5′-AAGCTCCAGGTTGGAAGTTGAG-3′，VIP下游引物：5′-GCTGCCGTGTTACATAAAGCAA-3′，擴增片段長度為210bp；β-actin上游引物：5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′，β-actin下游引物：5′-TGTATGCCTCTGGTCGT-ACCAC-3′，擴增片段長度為592bp。

3 實驗結果 3.1便量首粒黑便排出時間的影響 與空白組比較，模型組大鼠排便量減少，首次黑現時間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較，硝菔通結方各劑量組大鼠排便量增加，首粒黑現時間均明顯縮短(P<0.01)，見表1。

表1 首粒黑便排除時間的影響

組 別劑量(g/kg)糞便量(g)首粒黑便排除時間(min)空白-7.91±1.18177.66±21.50模型-5.13±0.69△287.69±25.99△硝菔通結方3808.22±1.99▲169.45±23.99▲ 1907.42±1.32▲184.24±13.43▲ 956.08±1.40206.74±38.49▲

注：與空白組比較△P<0.01；與模型組比較▲P<0.01。

3.2 大鼠血清中SP、 NO、 5-HT的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中SP含量低于空白組(P<0.01)；NO含量高于空白組(P<0.01)； 5-HT含量高于空白組(P<0.05)。與模型組比較，硝菔通結方大、中劑量組大鼠血清中SP水平明顯升高(P<0.01)，小劑量組無顯著性差異；大劑量組NO水平明顯降低 (P<0.01)，中劑量組NO含量也降低(P<0.05)，而小劑量組無顯著性差異；大劑量組大鼠的5-HT水平明顯降低 (P<0.01)，而中小劑量組無顯著性差異，見表2。

3.3大鼠結腸組織中VIP mRNA水平 與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中VIP mRNA表達明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，硝菔通結大、中劑量組大鼠結腸組織中VIP mRNA表達明顯升高(P<0.01)，硝菔通結小劑量組也有升高(P<0.05)，見表3。

表2 硝菔通結方對大鼠血清中SP、 NO、 5-HT的影響

注：與空白組比較△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較◇P<0.01。

表3 硝菔通結方對功能性便秘大鼠結腸

注：與空白組比較△P<0.01；與模型組比較▲P<0.05，◇P<0.01。

4 討 論 功能性便秘多發于體質衰弱及老年人群。周永學教授取治療腎虛便秘的濟川煎組方中的肉蓯蓉、當歸，結合軟堅散結、理氣通便，確立了硝菔通結方(肉蓯蓉、當歸、芒硝、萊菔)溫腎益精養血，軟堅潤下通便，治療功能性便秘療效確切，且不含蒽醌類成份。

腸神經系統可獨立調節腸道功能,其在功能性便秘中的改變具有重要意義。SP、5-HT、NO和VIP是調節腸道功能的重要腸神經遞質，它們可以通過抑制或興奮作用來調節腸道運動。SP能抑制胃腸道黏膜分泌,刺激腸道運動。實驗發現，便秘大鼠腸肌間神經叢SP含量明顯下降,同時伴有腸道運動功能下降[1]。Yik 等觀察兒童慢傳輸性便秘患者時也發現 SP 明顯降低，且女性降低發生率( 40%) 高于男性( 20%)[2]。NO與腸動力有密切關系，可以調節腸黏膜血流和分泌功能，并可使腸道平滑肌直接松弛，從而影響腸道的排便功能。5-HT可以介導腸神經系統對胃腸道調節， 5-HT能使腸道蠕動加快，腸道分泌增多，并有改善腸壁血液循環的作用。近年來大量人體和動物實驗也證實了5-HT與腸道動力及感覺異常有[3-5]。VIP是肽能神經遞質,也是ENS中抑制性神經遞質之一,具有使胃腸道平滑肌松弛和舒血管作用[6,7]。腸道組織中VIP能神經元及其神經纖維分布的減少可以導致腸道的分泌功能減弱，分泌的腸液量減少, 進一步使腸道推動作用減弱，引起便秘。

本研究證明功能性便秘大鼠血清中SP水平明顯降低，NO、5-HT水平明顯升高，結腸組織中VIP mRNA水平明顯降低。硝菔通結方能改善功能性便秘大鼠的便秘癥狀，同時能提高功能性便秘大鼠血清中SP水平，降低NO、5-HT水平，提高結腸組織中VIP mRNA的表達水平，尤以大劑量組效果最為明顯。硝菔通結方治療功能性便秘的作用機制可能與調節場神經遞質相關，且有一定劑量依賴性。

[1] 王 梅,呂 賓,范一宏,等.刺激性瀉劑對大鼠結腸肌間神經叢超微結構的影響[J].基礎醫學與臨床,2005,25(4):434-436.

[2] Yik YI，Farmer PJ，King SK，etal． Gender differences in reduced substance P( SP) in children with slow - transit constipation[J]． Pe-diatr Surg Int，2011，27(7) : 699 -704．

[3] 張衛平, 江 濱. 五羥色胺與慢性便秘[J].世界華人消化雜志, 2011，19(24): 2551-2554.

[4] Kim YS, Choi SC, Park JM, Choi CH, Lee DH,Son HJ, Sung IK, Jeong JJ, Lee JS, Shim KN, LeeKJ, Hong SJ, Choi MG. The effect of tegaserod on symptoms and quality of life in korean women with irritable bowel syndrome with constipation. J Neurogastroenterol Motil 2010，16: 61-70.

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(收稿2014- 09-09；修回2014-11-02)

Effect of Xiaofu Tongjie decoction on intestinal neurotransmitters of rats with functional constipation

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu 610072)

Wang Yujin Zhou Yongxue Zhang Hong et al

Objective: To explore the effect of Xiaofu Tongjie decoction on expression of intestinal neurotransmitters SP, NO, 5-HT, VIP of rats with functional constipation .Methods: Adult male SD 50 rats were randomly divided into control group, model group, Xiaofu Tongjie decoction high, medium, low dose group with 10 rats in each group. Using compound diphenoxylate tablets orally molding functional constipation model, after the success of modeling, the treatment group was given Xiaofu Tongjie prescripition gavaged. Observed the rats general performance, the time of first black stool. Detected of rats’ SP, NO, 5-HT level in serum by Elisa, detected of VIP mRNA level in colon tissue by Q-PCR. Results: Compared with the control group, the model group rats feces quantity was little, the time of first black stool significantly prolonged; serum SP levels decreased significantly, NO, 5-HT level increased significantly; VIP mRNA level in colon tissue decreased. Compared with the model group, Xiaofu Tongjie decoction each dose group rats increased fecal,the time of first black stool is shortened; the SP, NO, 5-HT levels in serum are decreased; VIP mRNA level in colon tissue increased. The changes of high dose group was most obviously. Conclusion: It is probably that the occurrence of functional constipation in rats was related to abnormal expression of neurotransmitters. The mechanism of Xiaofu Tongjie the rpesctipti in the treatment of functional constipation may be through changes the expression of neurotransmitters in enteric nervous system, SP, NO, 5-HP, VIP.

Constipation, function/integrated Chinese traditional and western medicine therapy @Xiaofu Tongjie decoction Animal experimentation Rats

*國家自然科學基金(81273663);國家課題重大專項(2012ZX09103201-037)

便秘, 功能性/中醫藥療法 @硝菔通結方 動物，實驗 大鼠

R271.11

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.058

△通訊作者

▲陜西中醫學院(咸陽 712046)

◇陜西省胃腸病證方藥重點研究室(咸陽 712046)