黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立

陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕

上海中醫藥大學附屬龍華醫院藥劑科 (上海200032)

△通訊作者

黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立

陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕△

上海中醫藥大學附屬龍華醫院藥劑科 (上海200032)

目的：建立黃連解毒湯水煎液高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜，為黃連解毒湯的質控提供依據。方法：采用HPLC-DAD檢測器，XDB-C18PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm)；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸水，流速為1 mL/min，柱溫：25℃，檢測波長：280 nm、240nm，梯度洗脫黃連解毒湯樣品。結果：建立了含有30個色譜峰的高效液相色譜圖，均得到了良好的基線分離；同時對鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷等指標成分進行了含量檢測。結論：該方法簡便快捷、精密度高、重現性好、回收率穩定，可用于黃連解毒湯的質量控制。

本實驗收集了10個批次不同產地、不同生產時間、不同廠家的黃連、黃芩、黃柏、梔子等藥材，按處方比例交叉組方后通過高效液相色譜法(HPLC)建立了黃連解毒湯水煎液的HPLC指紋圖譜，并對其方法學進行了考察，同時測定其中三大類(黃酮類、生物堿類、環烯醚萜類)7種成分(鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷)的含量，為該方的全面質量控制提供依據。

1 儀器與材料 儀器：美國惠普公司的Agilent 1100高效液相色譜儀、上海醫科大學儀器廠的XW-80A旋渦混合器、上海必能超聲儀器公司的SB2200 超聲儀、上海醫用分析儀器廠的Sartorius BS110S精密電子天平、TGL-16G 臺式高速離心機、鄭州長城科工貿有限公司的SHB-III循環水式多用真空泵、上海躍進醫療器械廠的XMT-152電熱恒溫干燥箱。

試劑：HPLC甲醇(德國默克公司)、HPLC乙腈(德國默克公司)、磷酸(上海聯合化工廠)、所用水均為純凈水，通過Milli-Q 水處理系統(Millipore, Bedford, MA, USA)進行處理。

對照品：梔子苷(批號110749-200714)，鹽酸巴馬汀(批號110732-200907)，鹽酸小檗堿(批號110713-200208)，黃芩苷(批號110715-200413)，黃芩素(批號111595-0200905)等均購自中國藥品生物制品檢定所(純度>99%)。鹽酸藥根堿(批號110733-201108)，漢黃芩素(批號111514-200403)等購自中國食品藥品檢定研究所(純度>99%)。

藥材：按處方量交叉組合不同批次的黃連、黃芩、黃柏、梔子藥材，組成10個批次的黃連解毒湯(見表1)。

2 方法與結果 色譜條件：采用XDB-C18 PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm)；通過流動相A為乙腈和流動相B為0.1%磷酸水進行梯度洗脫，具體條件如圖1所示；流速為1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：280 nm(梔子苷檢測波長為240 nm)；進樣量：5 μL；檢測時間：90 min。

圖1 黃連解毒湯色譜條件

對照品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿4 mg、鹽酸藥根堿0.6 mg、鹽酸巴馬汀0.8 mg、黃芩苷4.7 mg、黃芩素0.65 mg、漢黃芩素0.65 mg、梔子苷7.2 mg，將所稱取的藥品分別置于5 mL量瓶，應用甲醇定容，并進行不同濃度的稀釋，0.22 μm微孔濾膜濾過即為對照品溶液。

供試品溶液的制備：對組合成的10個批次黃連解毒湯分別加10倍量水進行處理，冷浸30min，武火加熱至沸后文火保持微沸20min，注意趁熱過濾，再加水8倍量，武火加熱至沸后轉為文火微沸20min，并趁熱過濾，將2次濾液進行合并。用10mL的量瓶分裝合煎液，每瓶各2mL，再加甲醇約至10mL，超聲提取20 min，冷卻至室溫，補充溶劑至刻度，搖勻，靜置過夜后，取上清液，進行離心(10,000 轉/min)10 min，再經過0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

表1 藥材產地及購買廠家來源

標準曲線的制定：將對照品溶液精密吸取注入色譜儀，進樣量為5 μL，測定峰面積按2.1項方法，以峰面積為縱坐標，對照品含量為橫坐標，制定標準曲線。

精密度及加樣回收率試驗：按高、中、低劑量將同一份黃連解毒湯(JQZJ3)分別加入對照品溶液，按2.3項下的處理得供試品溶液，連續測定3次分別于1d內完成，以5μL為每次進樣量，記錄峰面積，計算回收率、日間及日內精密度。分別測定各對照品的最低檢測限(LOD)及最低定量限(LOQ)于信噪比(S/N)為3、10時。

穩定性試驗：取同一份黃連解毒湯的供試品溶液，在0,2,4,24,48 h分別進樣5 μL，記錄峰面積，計算RSD，考察色譜條件的穩定性。

重現性試驗：選取黃連解毒湯合煎液2 mL，按2.3項下藥液處理方法平行處理3份樣品，按照2.1項下色譜條件，進樣5 μL，考察方法重現性。

供試品測定：按照2.1.項下色譜條件，進樣3 μL，檢測分析，記錄90 min色譜圖，每個供試品溶液進樣3次，建立黃連解毒湯合煎液的HPLC指紋圖譜。

數據統計：參照建立的標準曲線，采用回歸分析的方法計算樣品指標成分的含量。

以參照物對應的色譜峰(s)的相對保留時間和峰面積為1，各指紋峰保留時間與同一圖譜中對照峰的保留時間的比值為各指紋峰的相對保留時間RRT)，各指紋峰峰面積與同一圖譜中對照峰的峰面積的比值為各指紋峰的相對峰面積(RPA)，計算各批藥材指紋圖譜的共有峰的RRT和RPA。

采用國家藥典委員會開發的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004年A版)，疊加供試品的指紋圖譜。對各批次藥材及煎液運用夾角余弦法計算相似度。根據幾何學多維空間的向量夾角制定向量余弦法，把兩個指紋當作兩個向量，計算夾角余弦相似度，進行相似度分析。

圖譜情況：從供試品圖譜可以看出，在現有色譜條件下，7個指標成分在280 nm檢測波長下均得到良好的基線分離(圖2)。而梔子苷在240 nm檢測波長下峰型更清晰可見，因此，這里將黃連解毒湯在240 nm檢測波長下的指紋圖譜單獨列開，以更好的觀察指標成分梔子苷(圖3)。

檢測波長為280 nm時一共得到30個共有峰，其中3為梔子苷，15為鹽酸藥根堿，17為黃芩苷，18為鹽酸巴馬汀，19為鹽酸小檗堿，27為黃芩素，28為漢黃芩素(圖2)。

(3:梔子苷,15:鹽酸藥根堿,17:黃芩苷,18:鹽酸巴馬汀,19:鹽酸小檗堿,27:黃芩素,28:漢黃芩素)

圖3 黃連解毒湯傳統煎煮色譜圖 (240 nm)(1:梔子苷)

方法學結果表明：各指標成分在相應的范圍內，均有良好的相關系數(>0.9994)，線性關系良好(表2)；除了黃芩素日間RSD=10.32%外，各指標成分的日內及日間RSD均<2.50%，肯定了本方法的精密度；定量限及最低檢測限均能滿足樣品測定的要求；梔子苷回收率為92.47%～106.86%，鹽酸小檗堿回收率為110.97%～115.14%，鹽酸藥根堿回收率為基本為112.26%～116.26%，鹽酸巴馬汀回收率為111.97%～112.65%，黃芩苷回收率為105.46%～107.69%，黃芩素回收率為87.32%～101.09%，漢黃芩素回收率為98.43%～110.14%，表明回收率良好。供試品主要指標的成分保留時間控制在：RSD為0.05%～0.33%，相對峰面積RSD為0.18%～1.72%，由此可知該試驗方法在48h內基本穩定。主要指標成分相對保留時間的RSD均<0.8%，相對峰面積的RSD在1.09%～4.83%之間，表明該方法重現性良好。總言之，現有色譜法精密度、穩定性、重現性、回收率良好，可以進行下一步分析。

表2 標準曲線的制定

對照品回歸方程相關系數(r)線性范圍(μg)梔子苷y=1349.21x-20.740.9999660.11～7.20鹽酸巴馬汀y=1429.77x+2.550.9999330.16～1.12鹽酸藥根堿y=1485.35x+13.330.9996990.12～0.60鹽酸小檗堿y=1215.79x+18.850.9997680.12～3.20黃芩素y=2810.60x-31.250.9997130.07～0.78漢黃芩素y=4144.87x-31.020.9998530.02～0.65黃芩苷y=2445.25x-67.110.9994320.48～4.70

指標成分含量結果：對黃連解毒湯水煎液不同批次的成分進行分析，結果表明(表3)：不同批次的指標成分含量具有一定差異，RSD在8.91%～45.38%之間，有的成分含量甚至可以相差數倍，如ZW17與ZW18中的黃芩苷、ZW18與ZW20中的黃芩素。

表3 不同批次黃連解毒湯水煎液指標成分含量(mg/g)

相似度結果：在黃連解毒湯水煎液圖譜中，黃芩苷峰在10批合煎液中基本一致，且黃芩苷有合理的洗脫時間和已知的藥理活性，因此將黃芩苷選為參照峰。以此為對照計算相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1%，但是相對峰面積的RSD較大，說明藥液各批次的保留時間相對穩定，但各批次峰面積含量有一定差異。

3 討 論 黃連解毒湯首載于《肘后備急方》，為清熱解毒經典名方，具有鎮痛、抗炎、抗腫瘤、抗真菌、抗血小板、抗氧化等藥理作用[1-4]。可以單獨或聯合其他藥物治療不穩定型心絞痛、糖尿病、骨髓瘤、肛周膿腫以及神經系統等多種疾病[6-10]。從藥物學角度來看，黃連解毒湯的理化性質差異較大、化學成分較多、分離難度較大等，因此先前的很多研究報道都局限在整體藥效學的研究，而缺乏對其全方經配伍組合、煎煮后的藥理變化的深入探討[11-14]。故此，本文著重研究該方煎煮后湯劑的化學特征。

目前，指紋圖譜是一種已經應用成熟的分析方法，既有量的測定，又有質的特征檢測，對研究對象可作出全面、綜合地反映，較好的體現中藥成分的復雜性和相關性。在中醫藥現代化的研究中，將指紋圖譜質量評價體系引入到相關研究的成果較少，本實驗建立了黃連解毒湯的HPLC指紋圖譜，并采用相似度分析對指紋圖譜進行了評價。結果表明，不同批次的黃連解毒湯指紋圖譜特征、指標成分的含量存在一定差異，這說明產地、采收、加工方式、存儲時間和方法以及煎煮過程對湯劑的質量均存在可能的影響。然而，如何將指紋圖譜的豐富信息綜合起來來評價中藥質量是本文不足之處，有待今后將各種化學信息、藥效信息綜合起來，從而更系統地評價藥物質量。

同時，從本次研究過程來看，高效液相色譜法在應用中可以收集到藥品定性、定量的雙重信息，可以將復雜的方劑化學成分進行個體化區分。這種點面結合的研究方法，是適合于中藥方劑復合型組成特點的。在未來的探索中，我們應注重與方劑生產的實際結合，在目前中醫藥需求市場日益擴大的情勢下，力圖為中醫藥現代化生產提供相應的參考依據，使科學研究成果高效的轉化為實際生產的方法。

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(收稿2014- 08-15；修回2014-11-25)

黃連解毒湯 @高效液相色譜法

O657.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.054