復方龍脈寧滴丸中葛根素和薯蕷皂苷純化工藝研究*

董泰瑋 王昌利 史亞軍 陜西中醫學院(咸陽712046)

復方龍脈寧滴丸中葛根素和薯蕷皂苷純化工藝研究*

董泰瑋 王昌利△史亞軍 陜西中醫學院(咸陽712046)

目的：篩選復方龍脈寧滴丸中葛根素和薯蕷皂苷的純化工藝。方法：采用HPLC分析方法，以葛根素和薯蕷皂苷含量為評價指標，分別對樹脂類型、洗脫乙醇濃度、上樣量、洗脫速度和洗脫體積影響因素進行優選。結果：優化的最佳工藝條件為用AB-8大孔樹脂進行純化，上樣量與樹脂比為1 mL：1g，以0.5 BV/h的速度80%乙醇洗脫，4BV可洗脫完全，葛根素回收率為96.62%，薯蕷皂苷回收率為97.79%。結論:此純化工藝參數合理，重復性好，為復方龍脈寧滴丸進一步研究奠定了良好的基礎。

復方龍脈寧滴丸是陜西中醫學院附屬醫院腦病科陶根魚教授在長期臨床應用的基礎上，通過基礎研究篩選出來的主要針對心腦血管疾病，湯劑臨床療效好，經前期動物實驗研究復方龍脈寧滴丸具有擴張血管和改善微循環的作用[1]。該復方由葛根、穿山龍、川芎、蜂膠四味藥組成，葛根為方中君藥，其有效成分是異黃酮類化合物，有大豆苷元、大豆苷、葛根素等，葛根素改善微循環障礙，冠狀動脈擴張劑，增加冠狀動脈血流量，減少心肌氧耗量，抑制血小板凝集[2]。方中穿山龍為佐藥，有抗炎、擴張冠狀動脈、抗動脈硬化、調節代謝等作用，其主要活性成分為甾體皂苷，薯蕷總皂苷改善冠脈血液循環，降低動脈壓，減慢心率，增強心肌收縮的作用[3]。

本課題組前期對復方龍脈寧滴丸質量標準、純化工藝進行研究[4-6]。但前期都是以復方提取液中葛根素為評價指標，而對于方中其他指標未進行考察。因此本實驗以葛根素和薯蕷皂苷為評價指標，通過大孔吸附樹脂純化富集實驗的思路，以期為進一步研究提供合理可行的參考依據。

1儀器與試藥 1.1儀 器 日立雙泵系統液相色譜儀(批號：LC-7000A)；PH計(奧立龍PHS-3C)；旋轉蒸發器RE-3000；AR1140 Mettler Toledo電子天平，精密度：萬分之一)；KH-400KDE型高功率數控超聲清洗器。

1.2 試 藥 葛根素對照品(批號:110773-201012)，薯蕷皂苷對照品(批號:111707-200501)，兩種對照品均由中國藥品生物制品檢定所測定。葛根為豆科植物野葛的干燥根莖，穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷的干燥根莖，并經陜西中醫學院藥學院生藥教研室王繼濤教授鑒定。乙腈為色譜純，水為蒸餾水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果 2.1色譜條件 測定葛根素色譜條件：色譜柱HypersiL ODSC18(5μm，4.0mm×150mm)；甲醇-水流動相(25:75)；檢測波長：250 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min[7]。

測定薯蕷皂苷的色譜條件：色譜柱HypersiL ODSC18(5μm，4.0mm×150mm)；乙腈-水流動相(54∶46)；檢測所得波長210 nm；柱溫度：25℃；流速：1.0 mL/min[8]。

2.2 溶液的制備 對照品葛根素溶液的制備:葛根素標準品精密稱取12.5 mg，用乙醇超聲溶解，定容至25 mL，混勻；將該液精密吸取1 mL置于10 mL容量瓶，用乙醇定容，濃度為0.05 mg/mL，4℃冷藏備用。對照品薯蕷皂苷溶液:薯蕷皂苷對照品精密稱取7.6 mg，用70%乙醇溶解，定容至10 mL,濃度0.76 mg/mL，4℃冷藏備用。

樣品溶液的制備:在前期實驗中，已經確定了提取工藝，取葛根300 g，川芎200 g，穿山龍200 g，以8倍量70%乙醇，提取3次，每次2 h，回收乙醇，濃縮至1000 mL[9]。該工藝中葛根素和薯蕷皂苷的提取率分別為4.26% 、1.38%。

2.3 方法學建立 葛根素標準曲線的制備:葛根素對照品溶液精密吸取分別5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”項下色譜條件測定其峰面積，以峰面積A為縱坐標，葛根素含量C(μg)為橫坐標，回歸方程：A=107x+106，R2=0.9991，線性范圍為0. 25 μg～1. 25 μg。薯蕷皂苷標準曲線的制備:精密吸取薯蕷皂苷對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”項所設色譜條件對峰面積進行測定，以峰面積A為縱坐標，薯蕷皂苷含量C(μg)為橫坐標,得線性方程：C=488639x+433142，R2=0.9995，線性范圍為值3.80 μg～19.00 μg。

精密度:對葛根素和薯蕷皂苷對照品進行精密吸取，各取10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，連續進樣6次，得RSD值分別為0.78%和1.05%，表明儀器精密度良好。

穩定性:精密吸取“2.2”項下稀釋后的樣品溶液10 μL，分別于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h進樣，按“2.1”項下色譜條件測定葛根素和薯蕷皂苷峰面積，得RSD值分別為2.56%和1.89%，表明樣品在12 h內穩定性較好。

重復性:按照“2.2”項下配比及提取方法制備樣液，平行制取6份，以“2.1”項下色譜條件分別測定葛根素及薯蕷皂苷的峰面積，計算獲得RSD值分別為2.32%和2.51%，表明樣品重復性較好。

加樣回收率:精密吸取供試品溶液1 mL，各2份，分別加入等量葛根素對照品溶液與薯蕷皂苷對照品溶液，混勻，按“2.1”項下色譜條件進樣10μL，測定葛根素和薯蕷皂苷峰面積，經計算得葛根素的平均回收率為98.64%，RSD為2.71%。薯蕷皂苷的平均回收率為97.43%，RSD為0.24%。

2.4 洗脫條件的優選 樹脂的處理:分別取適量AB-8，D101大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，裝入洗脫柱，用95%乙醇沖洗，直至流出液1 mL加4 mL蒸餾水不呈白色渾濁為止，然后用蒸餾水以同樣流速洗至無醇味，備用。

樹脂類型的選擇:分別取已處理好的AB-8，D101大孔樹脂適量于兩根柱子中，各加入2BV的藥液，用10BV的70%乙醇洗脫，收集全部洗脫液，稀釋10倍后，照“2.1”項下各色譜條件測定峰面積，進樣2 μL測定葛根素含量，進樣10 μL測定薯蕷皂苷的含量，測定結果見表1[2,10-12]。由表1可知兩種樹脂無明顯差別，鑒于AB-8價格低于D101，選擇AB-8樹脂。

表1 大孔樹脂類型的選擇(mg)

樹脂類型葛根素洗脫量薯蕷皂苷洗脫量AB-82.03304.2315D1011.99314.2203

洗脫濃度的選擇:取2g處理好的樹脂各7份，加入5 mL樣品溶液充分吸附振蕩，放置24 h。用清水洗去多余藥液，加入30%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇各10 mL，放置12 h，制樣。照“2.1”項下各色譜條件測定峰面積，計算洗脫量，結果見表2。由表2可知葛根素的最佳洗脫濃度為80%的乙醇，薯蕷皂苷則為95%的乙醇，考慮到葛根為君藥，且80%與95%乙醇洗脫時薯蕷皂苷差別不大，所以選擇80%乙醇作為洗脫劑。

表2 不同醇濃度洗脫量

測定指標30%50%60%70%80%95%葛根素0.70230.29093.60114.44824.91760.0531薯蕷皂苷0.94570.92500.96330.97000.98200.9912

藥材上樣量的確定:分別取1g、2g、3g、4g、5g、6g樹脂各加入5 mL藥液振蕩24 h，靜置，取上清液，稀釋10倍，照“2.1”項下各色譜條件測定葛根素和薯蕷皂苷峰面積，計算不同樹脂中各指標的吸附率，確定上樣藥液和樹脂比，結果見表3。由表3可知5 mL藥液葛根素需要4 g樹脂吸收，而薯蕷皂苷需5 g樹脂，故上樣量與藥材比為1 mL：1g。

表3 上樣量的選擇

樹脂量(g)葛根素吸附率(%)薯蕷皂苷吸附率(%)175.7540.61295.7263.45310082.80410092.5451001006100100

藥材洗脫速度的確定:本實驗采用靜態吸附-動態解析的方法，按1g∶1 mL的樹脂與藥材比例上樣后，分別以0.5 BV/h、1.0 BV/h、2.0 BV/h的速度洗脫，收6BV的洗脫液，照“2.1”項下各色譜條件測定峰面積，計算葛根素和薯蕷皂苷的洗脫率，結果見表4。由表4可知洗脫速度對葛根素的影響不大，對薯蕷皂苷的影響顯著，故選擇0.5 BV/h的洗脫速度。

表4 洗脫速度的選擇

洗脫速度(BV/h)葛根素洗脫率(%)薯蕷皂苷洗脫率(%)0.588.9796.42176.7583.56257.9464.26

最佳洗脫量的選擇:80%乙醇以0.5 BV/h的速度對過量飽和的AB-8樹脂進行洗脫，1BV收集一份濾液，共收集8份，照“2.1”項下各色譜條件測定葛根素和薯蕷皂苷的峰面積，計算累積洗脫率，結果見表5。由表5可知4BV可洗脫完全，因此最佳洗脫量為4BV。

表5 洗脫體積的選擇(%)

序號葛根素累積洗脫率薯蕷皂苷累積洗脫率190.8657.79299.6179.643100.1593.354100100.785100100610010071001008100100

3 討 論 本實驗針對處方中葛根素和薯蕷皂苷進行富集純化，以便簡化工藝，為復方龍脈滴丸的進一步研究提供依據。

大孔樹脂的純化原理是吸附和分子篩作用綜合的結果,吸附作用是由于范德華力或氫鍵的作用讓物質與樹脂緊密結合；而分子篩作用則是由于樹脂間的多孔結構減弱了物質之間的吸附力,使得有機溶劑易洗脫有效成分。本實驗葛根素的最佳洗脫濃度為80%的乙醇，薯蕷皂苷則為95%的乙醇，葛根為君藥，且80%與95%乙醇洗脫時薯蕷皂苷差別不大，所以選擇80%乙醇作為洗脫劑。

適宜的上樣液量是富集純化目標成分的重要因素,既能防止有效成分的流失, 又能保證大孔樹脂不浪費。本研究固定藥液體積依次增加樹脂用量來考察上樣量，由實驗結果表3可得上樣量與樹脂比值為1 mL∶1g時，兩種成分吸附均較好。洗脫速率對于成分的遷移及分離具有重要影響，太快時成分很難達到理想的分離，過慢則易形成死吸附。本試驗發現洗脫速度對葛根素的影響不大，而隨著洗脫速率的逐漸增大，薯蕷皂苷的洗脫率顯著減小，故選擇0.5 BV/h的洗脫速度。合適的洗脫劑用量既可以對目標成分達到富集作用，又可以大量減少洗脫劑用量，以減少成本。由表5可知4BV可洗脫完全，若繼續洗脫，不但會增加實驗強度，而且會浪費很多溶劑，因此選擇4BV進行洗脫。

綜合以上影響因素，本試驗通過靜態吸附、動態解吸的方法,最終選擇以AB-8樹脂為復方龍脈寧滴丸的純化樹脂 ，80%乙醇以0.5 BV/h的速度上樣量與樹脂比為1 mL：1g進行洗脫，4BV可洗脫完全，此工藝條件下葛根素回收率為96.62%，薯蕷皂苷回收率為97.79%。該方法簡單易行，重現性好，對生產和臨床具有較好的參考意義。

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(收稿2014- 09-12；修回2014-10-15)

*陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2012KTCQ03-13);國家自 然科學基金項目(81373944);陜西省中藥制藥重點學科資助

葛根素 薯蕷皂苷 @復方龍脈寧滴丸

R283

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.051

△通訊作者