經方鱉甲煎丸抑制H22肝癌細胞血管生長的實驗研究*

湯新躍

廣東省第二人民醫院腫瘤二科 (廣州 510317)

經方鱉甲煎丸抑制H22肝癌細胞血管生長的實驗研究*

湯新躍

廣東省第二人民醫院腫瘤二科 (廣州 510317)

目的：探討經方鱉甲煎丸對H22肝癌細胞荷瘤小鼠血管生長的抑制效果，為鱉甲煎丸在肝癌治療的臨床應用提供動物實驗理論依據。方法：選用120只昆明小鼠，以H22肝癌細胞建立H22荷瘤小鼠動物模型，隨機分為A組、B組、C組和D組各30例，A組為高劑量鱉甲煎丸灌胃服用，B組為低劑量鱉甲煎丸灌胃服用，C組為環磷酰胺注射液腹腔注射，D組為陰性對照組，連續用藥15d后將其處死，剝離瘤塊并檢測腫瘤組織的微血管計數和血管內皮生長因子表達陽性的細胞面積占腫瘤細胞面積的比例并進行對比。結果：A組小鼠的微血管計數結果為(4.08±1.32)條，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的微血管計數結果為(7.72±1.51)條，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)；A組小鼠的血管內皮生長因子表達陽性細胞所占面積為(2.32±1.08)%，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的血管內皮生長因子表達陽性細胞所占面積為(5.61±1.42)%，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)，C組小鼠的血管內皮生長因子表達陽性細胞所占面積為(9.21±3.36)%，顯著少于D組小鼠(P<0.05)。結論：鱉甲煎丸可顯著降低H22荷瘤小鼠肝癌組織血管內皮生長因子的表達，抑制新生微血管的生成，進而對腫瘤組織的生長和轉移有一定的抑制作用。

鱉甲煎丸出自于張仲景的《金匱要略》，其方藥組成較多，具有平調寒熱、攻補并用、軟堅散結、行氣化瘀的作用。《金匱要略》中以瘧病日久引起的瘧母、癥瘕為其主治證。然而，隨著現代研究的深入，鱉甲煎丸的臨床應用得到了不斷的擴展，目前已經有應用鱉甲煎丸治療肝硬化、肝吸蟲等，同時也有動物試驗證實，鱉甲煎丸具有一定的抗肝纖維化、腎間質纖維化的作用[1-2]。在腫瘤的治療上，鱉甲煎丸也有治療肝癌的報道，且取得一定的臨床療效[3]。然而，由于本方所包含的方藥較多，且用法較為獨特，而其治療肝癌的報道多為個案研究，較少藥理及動物實驗的數據支撐，這將直接影響鱉甲煎丸進一步臨床應用。本研究觀察鱉甲煎丸對H22肝癌細胞血管生長的抑制效果，為鱉甲煎丸在肝癌治療上的臨床應用提供現代動物實驗理論依據。

1 實驗材料和方法

1.1 主要試驗材料 本研究所用120只雄性昆明種小鼠均由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，小鼠體重為18～22g。隨機將上述小鼠分為A組、B組、C組和D組各30只。H22荷瘤小鼠模型則由中山醫科大學腫瘤研究所提供。本研究所用鱉甲煎丸由武漢中聯藥業集團股份有限公司提供，國藥準字Z42020772，環磷酰胺注射液由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，國藥準字H32020856。

1.2 主要試劑 血管內皮生長因子一抗、生物素標記兔抗山羊二抗均由上海安研生物有限公司提供，SABC免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 研究方法 將接種了10dH22肝癌細胞的小鼠以頸椎脫臼法處死，蠟板固定后，將其腹腔內的腹水抽出。以相同體積的0.9%氯化鈉注射液將抽出的腹水稀釋后，采用0.2%臺盼藍染色，將腫瘤細胞懸液的濃度調整為6×106/mL。然后抽取0.2mL于每只小鼠的右后肢皮下注射，接種完成后24h開始各組小鼠給藥。鱉甲煎丸懸液的制備采用蒸餾水和鱉甲煎丸配制而成。分別配制濃度為0.024g/mL和0.048g/mL兩種濃度的鱉甲煎丸懸液，配制完成后，儲存于4℃的環境中備用。A組小鼠按照每天每公斤12g的劑量灌胃服用鱉甲煎丸懸液，B組小鼠按照每天每公斤體重6g的劑量灌胃服用鱉甲煎丸懸液，C組小鼠每天按照每公斤體重20mg的劑量腹腔注射環磷酰胺注射液，D組小鼠每天蒸餾水灌胃。四組小鼠均按照各自方案用藥15d后處死，剝離腫瘤后稱重，并檢測腫瘤的相關指標。

1.4 觀察指標 分別檢測瘤塊內的微血管計數和血管內皮生長因子的水平。瘤塊內微血管計數的檢測方法如下：分別在每組小鼠瘤體的不同部位取出5個體積為5mm×5mm×2mm的標本，取標本時注意避開出血部位和邊緣反應區。所取的標本經過HE染色，現在40倍顯微鏡下標記血管計數最高的3個區域，然后通過100倍顯微鏡在相應區域計數，統計每個高倍鏡視野中的微血管計數。計算微血管數目時，對于有較厚血管平滑肌或者管腔面積超過8個紅細胞面積的血管忽略不計，這樣可避免較大的血管影響計數的準確性。以5個部位計數結果的平均值為最終的微血管計數結果。血管內皮生長因子水平的檢測方法如下：瘤塊剝離后，經過固定、脫水、浸蠟、包蠟、切片5個步驟處理后，采用SABC免疫組化試劑盒對其血管內皮生長因子水平進行檢測。如果細胞的胞質、胞膜有棕黃色著色的判定為陽性細胞。以切片細胞著色明顯的區域取10個高倍視野進行計數，計算每個高倍視野中100個腫瘤細胞中，陽性細胞所占的比例。以細胞漿內有棕黃色為血管內皮生長因子陽性的判定標準，計算血管內皮生長因子陽性的細胞面積和腫瘤細胞面積的比值。對比四組小鼠的腫瘤微血管計數和血管內皮生長因子的檢測結果。

2 結 果 2.1 四組小鼠腫瘤組織微血管計數檢測結果的對比 A組小鼠的微血管計數結果為(4.08±1.32)條，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的微血管計數結果為(7.72±1.51)條，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)，見表1。

表1 四組小鼠腫瘤微血管計數檢測結果的對比

注：和A組對比，△P<0.05，和B組對比，▲P<0.05

2.2 四組小鼠腫瘤組織血管內皮生長因子檢測結果的對比 A組小鼠的血管內皮生長因子表達陽性細胞所占面積為(2.32±1.08)%，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的血管內皮生長因子表達陽性細胞所占面積為(5.61±1.42)%，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)，C組小鼠的血管內皮生長因子表達陽性細胞所占面積為(9.21±3.36)%，顯著少于D組小鼠(P<0.05)，見表2。

表2 四組小鼠腫瘤組織血管內皮生長因子檢測結果的對比

注：和A組對比，△P<0.05，和B組對比，▲P<0.05，和C組對比，◇P<0.05

3 討 論 鱉甲煎丸是目前臨床較為常用經方，近年來的臨床報道顯示，本方可用于肝纖維化、慢性肝炎、肝硬化等的治療中，同時在肝癌、胃癌等抗腫瘤的治療中，也證實具有較為肯定的療效[4-5]。然而，目前的臨床研究多為單純的案例報道，缺乏現代藥理或者實驗動物數據作為理論支撐，這將使鱉甲煎丸的廣泛應用受到限制。本研究試圖通過動物實驗的研究，為鱉甲煎丸在肝癌的治療上提供實驗數據支持。

臨床研究已經證實，惡性腫瘤的侵襲力與新生血管的產生有直接的關系，馬晨光[6]的研究顯示，血管內皮生長因子的濃度和胸部惡性腫瘤的惡性行為有密切的關系。林道浙等[7]的研究也證實，血管內皮生長因子濃度的檢測可用于評估肝癌的生物學行為和患者的預后。由于惡性腫瘤的代謝旺盛，其增殖、轉移均需要新生血管提供充足的血液供應，以保證腫瘤細胞的營養需求。血管內皮生長因子則在誘導腫瘤新生血管的產生上發揮了重要的作用，因此，檢測血管內皮生長因子的濃度有助于評估腫瘤的惡性程度和增殖的活躍程度[8]。本研究的結果證實，經過高劑量鱉甲煎丸懸液喂養的小鼠，其微血管計數和血管內皮生長因子表達陽性的細胞面積均最少，而低劑量鱉甲煎丸懸液喂養小鼠的微血管計數和血管內皮生長因子表達陽性的細胞面積也顯著低于單純環磷酰胺注射液腹腔注射的小鼠。這說明鱉甲煎丸能夠有效抑制血管內皮生長因子的表達，進而抑制肝癌組織新生微血管的生成，這與鄭艷等的研究結果基本一致[9]。同時，鱉甲煎丸服用劑量的增加能夠增強其抑制肝癌組織新生微血管生成的作用。由于腫瘤組織的血管密度越高，腫瘤細胞經進入血循環而發生轉移的風險越大，鱉甲煎丸的應用顯著抑制了微血管的生成，這不僅對腫瘤組織的生長有一定的抑制作用，同時也降低了肝癌細胞發生血行轉移的風險。羅慶東等[10]的動物實驗研究也證實，鱉甲煎丸可下調血管內皮生長因子及其受體的表達，進而對腫瘤的轉移有抑制作用。

綜上所述，鱉甲煎丸可顯著降低H22荷瘤小鼠肝癌組織血管內皮生長因子的表達，抑制新生微血管的生成，進而對腫瘤組織的生長和轉移有一定的抑制作用。

[1] 李志剛,谷 寧.阿德福韋酯聯合鱉甲煎丸治療活動性乙型肝炎肝硬化療效觀察[J].醫學信息,2012,25(7):280-281.

[2] 文 彬,賀松其,龐 杰，等.鱉甲煎丸對肝纖維化大鼠作用機制研究[J].中國中西醫結合消化雜志,2013,21(11):572-575.

[3] 王 涵.鱉甲煎丸治療肝癌體會[J].內蒙古中醫藥,2012,31(4):22.

[4] 羅慶東,姜德友.鱉甲煎丸的臨床研究與進展[J].齊齊哈爾醫學院學報,2012,33(6):764-766.

[5] 王 兵,侯 煒.《金匱要略》三丸方治療腫瘤探討[J].中醫學報,2013,28(10):1451-1453.

[6] 馬晨光.血管內皮生長因子檢測在胸部惡性腫瘤中的臨床意義[J].中國醫師進修雜志,2011,34(29):58-60.

[7] 林道浙,鄭一雙,李克誠，等.結直腸癌患者門靜脈血中血管內皮生長因子濃度與肝轉移的關系[J].上海醫學,2011,34(12):957-958.

[8] 李 丁,向 華.血管內皮生長因子在原發性肝癌中的診斷及預后意義[J].介入放射學雜志,2014,23(11):1018-1021.

[9] 鄭 艷,賀松其,文 彬,等.鱉甲煎丸對HUVEC增殖及HepG2中VEGF表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(20):132-136.

[10] 羅慶東,王月飛,趙紅曄，等.鱉甲煎丸對肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織生長及轉移的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(14):230-232.

(收稿2015-03-08；修回2015-04-06)

*廣東省中醫藥管理局科研立項(20131106)

肝腫瘤/中醫藥療法 @鱉甲煎丸 動物，實驗 小鼠

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.083