紅景天苷對百草枯誘發PC12細胞損傷的保護作用*

李海龍 吳守振 李 洺 馮曉霞

西安市第九醫院(西安 70054)

紅景天苷對百草枯誘發PC12細胞損傷的保護作用*

李海龍 吳守振△李 洺 馮曉霞

西安市第九醫院(西安 70054)

目的：研究紅景天苷保護百草枯(PQ)誘發PC12細胞損傷的作用及其機制。方法：實驗分對照組、PQ誘導組、不同劑量(10μmol/L、20μmol/L、30 μmol/L)紅景天苷治療組。采用MTT法檢測細胞活力，利用流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡；羅丹明123(Rh123)染色觀察細胞線粒體膜電位(MMP)變化，比色法測定乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽還原酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性；免疫組織化學染色檢測細胞色素C(CytC)的表達。結果：800 μmol/L PQ明顯抑制PC12細胞增殖、誘導細胞凋亡；以不同劑量(10μmol/L、20μmol/L、30 μmol/L)紅景天苷預處理后，保護了PQ所致的PC2細胞增殖抑制，降低凋亡率(P?0.01)。機制上，紅景天苷抑制了MMP下降(P?0.05)，導致LDH、CytC的釋放減少，增強了GSH-PX、SOD的活力(P?0.05)。結論：紅景天苷保護了PQ誘導的細胞損傷，抑制了PQ所致的細胞凋亡，這可能與抑制CytC的釋放和MMP下降，提高GSH-PX、SOD的活性有關。

紅景天苷是草本植物紅景天的主要化學成份之一，在抗衰老、抗疲勞、抗輻射、抗缺氧、抗腫瘤和抗病毒中具有重要作用，能夠有效調節免疫力[1-4]。百草枯(paraquat，PQ)具有與多巴胺能神經毒素(1-甲基-4-苯基吡啶離子，1-Methyl-4-phenylpyridin-1-ium，MPP+)相似的結構，可誘發氧化應激，誘發細胞凋亡[5-7]，激活多種信號通路，包括TGF-β信號通路，NF-κB信號通路以及胰島素信號通路等[8-10]。本研究將采用體外培養的PC12細胞，探討紅景天苷對PQ導致該細胞毒性損傷的影響。

1 材 料

1.1 試 劑 紅景天苷購自中國藥品生物制品檢定所(標準對照品，批號：110818-200404)，PQ、annexinV-FITC、PI(Propidium Iodide)、MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)、Rhodamine(Rh123)購自Sigma公司；DMSO、胎牛血清購自Gibco BRL公司；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-PX-Px)檢測試劑盒購自南京生物工程研究所。兔抗鼠CytC單克隆抗體(mAb)購自Pharmingen公司。

1.2 細 胞 PC12細胞系由第四軍醫大學神經生物實驗室饋贈，以含有10%胎牛血清的DMEM培養，并補充10 ng/mL神經生長因子、100 U/mL青霉素。培養細胞置于37℃、50 mL/L CO2培養箱中，待單層細胞60%～70%匯合后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養。

2 方 法

2.1 藥物處理 3×103個細胞接種于96孔板中，24 h加藥處理，分組如下：對照組；PQ誘導組：不同劑量PQ組；紅景天苷聯合PQ誘導組：不同劑量(10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L)紅景天苷預處理，24 h后加800 μmol/L PQ。各組均設3～5個平行對照組。

2.2 細胞活力測定 以3×103個細胞接種于96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37℃下孵育4 h，去除培養液，加入150 μL DMSO，溶解結晶，測定570 nm時的吸光度(A)值。細胞活力以與對照組相比的百分數表示。

2.3 流式細胞術檢測 收集各實驗組細胞，以PBS沖洗2次，700 mL/L冰乙醇重懸細胞，于4℃固定24 h；1 500 r/min 4℃離心5 min；PBS洗滌2次；將細胞重懸于結合緩沖液；分別加入annexinV-FITC (10 μL)和PI(5 μL)，于4℃避光孵育30 min，進行FCM檢測。

2.4 Rh123染色檢測MMP 細胞爬片后，將細胞于含10 μg/mL Rh123的Hank，s液中在37℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗2次，3 min/次；以福爾馬林固定45 min，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 LDH活力測定 通過LDH催化乳酸生成丙酮酸的量測定LDH活力。收集各組細胞的培養液，于4℃下800 r/min離心2 min，取上清液上酶標儀以波長440 nm檢測每孔的A值。

2.6 SOD、GSH-PX活力測定 利用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，用二硫對二硝基苯甲酸法測定GSH-PX的活力。處理各組細胞后，將細胞裂解后離心，各取100 μL細胞上清以酶標儀分別測定波長550 nm、412 nm下的A值。

2.7 PC12細胞CytC的表達 PC12細胞爬片，培養24 h，洗滌、固定、封閉，加入兔抗鼠CytC單克隆抗體(1：200)，37℃溫育1 h；，PBS洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1：100)，孵育30 min，DAB顯色；然后，進行蘇木素復染、乙醇脫水、二甲苯透明，封片。隨機選取8個視野，計數CytC陽性細胞數，計算百分比。

3 結 果

3.1 紅景天苷抑制PQ引起的PC12細胞活力下降 不同劑量(100、200、400、600、800、1000 μmol/L) PQ作用細胞，觀察其對細胞活力的影響。結果表明：與對照組相比，600μmol/L、800μmol/L和1000μmol/L PQ劑量組細胞生存率明顯下降(P?0.05，圖1A)。但是，當用不同劑量(10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L)紅景天苷預處理24 h，再加800 μmol/L PQ后，紅景天苷有效抑制了PQ所致的PC12細胞增殖活性的下降(P? 0.05)，與PQ組相比差異具有統計學意義(P?0.05，圖1B)，這些結果表明紅景天苷能夠有效保護制PQ誘導的PC12細胞的損傷。

圖1 紅景天苷對PQ誘導的PC12細胞的損傷保護作用

3.2 紅景天苷抑制PQ誘導的PC12細胞凋亡 結果顯示：與對照組相比，800 μmol/L PQ明顯增加促進了細胞凋亡，凋亡率為48.8%，而10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L紅景天苷預處理細胞24 h后，再加800 μmol/L PQ，細胞凋亡百分率分別為33.9%、21.1%、10.8%，與其它各組比較有統計學意義(圖2)，表明紅景天苷可有效抑制PQ誘導的PC12細胞凋亡，且這種抑制作用具有劑量依賴性。

3.3 紅景天苷抑制PQ引起的PC12細胞MMP的下降 PQ作用PC12細胞后，Rh123染色熒光強度從6.81減弱至0.78，細胞MMP顯著下降(P? 0.05，圖3B)；加入10μmol/L、20 μmol/L和30 μmol/L紅景天苷后，與PQ組相比，細胞MMP明顯增加，具有顯著性差異(P?0.05，圖3C-E)，表明紅景天苷有效地抑制了PQ誘導的細胞MMP下降。

3.4 紅景天苷抑制PQ誘導的PC12細胞LDH活性下降 與對照組相比，800 μmol/L PQ明顯增加了LDH釋放量(118.55±3.88VS217.27±5.99，P?0.05)，而分別用10 μmol/L、20 μmol/L和30 μmol/L紅景天苷預處理后，細胞LDH釋放量分別為177.34±5.59、152.70±5.15和119.82±6.04，與PQ組比較，具有統計學差異，說明紅景天苷降低了LDH的釋放，有效保護了PQ誘導的PC12細胞的損傷(圖4)。

3.5 紅景天苷增強PC12細胞SOD、GSH-Px活性 與對照組比較，PQ導致PC12細胞SOD和GSH-Px活性顯著下降(P?0.05)；10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L紅景天苷能夠明顯提高SOD和GSH-Px的活性(P?0.05)，提示紅景天苷對PQ減低的PC12細胞的SOD、GSH-PX的活性有明顯的改善作用(圖5)。

A：對照組； B：800 μmol/L PQ組； C：10 μmol/L 紅景天苷 + 800 μmol/L PQ 組；D：20 μmol/L 紅景天苷 + 800 μmol/L PQ 組； E：30 μmol/L 紅景天苷 + 800 μmol/L 組

圖2 紅景天苷對PQ誘導的PC12細胞凋亡的抑制作用

圖3 紅景天苷抑制PQ誘導的PC12 MMP表達的下調

2.6 紅景天苷抑制PQ誘導的PC12細胞CytC釋放 免疫組織化學結果顯示：正常組細胞形態良好，CytC均勻分布于胞質及突起內。PQ處理后細胞變圓、皺縮，CytC表達增強。紅景天苷預處理后，各組中CytC的表達減少，呈弱陽性(圖6)。

A：對照組； B：800 μmol/L PQ組； C：10 μmol/L 紅景天苷 + 800 μmol/L PQ 組；D：20 μmol/L 紅景天苷 + 800 μmol/L PQ 組； E：30 μmol/L 紅景天苷 + 800 μmol/L PQ 組

圖6 CytC 免疫組織化學染色結果 (400×)

4 討 論 帕金森病(Parkinson，sdisease，PD)是一種復雜的疾病，受多種因素影響。其中，自由基對神經元的損害是帕金森致病的一個重要因素[3]。百草枯與多巴胺能神經毒素MPP+具有相似的結構，能夠誘發氧化應激。紅景天苷在抗衰老、抗疲勞、抗輻射、抗缺氧、抗腫瘤、抗病毒中具有重要的作用，調節機體免疫力，有效保護神經發育和損傷。本課題以PC12細胞為模型，探討紅景天苷對PQ導致該細胞毒性損傷的影響，為紅景天苷治療PD提供實驗依據。

本研究中，我們以PQ成功誘導了PC12細胞的細胞毒性損傷，發現PQ能夠以劑量依賴性的方式影響PC12的細胞活力，這與以往的報道一致[11]，顯示PQ引發了PC12的細胞毒性損傷，其分子機制可能是抑制了PI3K/AKT信號轉導通路[12]。在細胞實驗中，我們選擇了800 μmol/L PQ作為我們實驗的作用濃度，因為這一濃度能夠有效誘導PC12的細胞毒性損傷。我們的研究發現，紅景天苷能夠有效地抑制PQ誘導的PC12細胞的細胞活力下降。進一步，我們的實驗結果表明，PQ對PC12細胞的活力影響主要是通過誘導細胞凋亡引起的，而紅景天苷逆轉了PQ誘導的PC12的細胞凋亡。這些結果表明，紅景天苷有效地抑制PQ誘導的PC12細胞毒性損傷。

SOD、GSH-PX是機體主要抗氧化酶，能夠有效清除自由基的產生。SOD、GSH-PX表達水平是神經系統衰老和損傷最為敏感和可靠的指標[13]。本研究中，我們檢測了PQ對PC12細胞中LDH、SOD和GSH-PX的表達和活力的影響，我們發現PQ抑制了LDH、SOD和GSH-PX的表達和活力，進一步表明，PQ能夠誘導PC12細胞的細胞毒性，并且與氧化應激有密切的關系。為此，我們研究了紅景天苷對氧化應激的保護作用。我們的結果表明，紅景天苷能夠抑制PQ能夠誘導PC12細胞的細胞毒性，恢復了LDH、SOD和GSH-PX的表達和活力。這些結果提示，紅景天苷可能是通過氧化應激酶發揮神經保護作用。

線粒體膜電位的穩定性有利于維持細胞正常生理功能，為ATP的合成和線粒體攝取Ga2+提供保障[14]。線粒體也是細胞內活性氧的主要來源，但是，過多活性氧將導致正常細胞和組織的損害，引發多種疾病，如老年癡呆、帕金森病等[15]。為此，我們觀察了紅景天苷對PQ誘導的PC12細胞線粒體膜電位及CytC的釋放的影響。實驗結果表明，PQ導致了PC12細胞的線粒體細胞膜電位下降和增加了CytC的釋放，提示產生了明顯的細胞毒性損傷。但是，紅景天苷處理后，能夠有效逆轉這一現象，使細胞線粒體膜電位增強，減少了CytC的釋放。

因此，我們的實驗結果表明紅景天苷對PQ誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，提高了細胞抗氧化能力，減少氧化應激損傷，維持了細胞線粒體正常功能，為其臨床應用治療PD提供了實驗依據。

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(收稿2015-01-05；修回2015-02-21)

The protective effects of salidroside against paraquat-induced PC12 Cell line damage

The Ninth Hospital of Xi'an City (Xi’an710054)

Li Hailong Wu Shouzhen Li Min et al

Objective：To explore the neuroprotective effect and related mechanisms of Salidroside against paraquat(PQ) induced the damage in pheochromocytoma (PC12) cells. Methods：Using PQ-induced PC12 cells damage as the model of Parkinson’s disease in vitro，Cells were divided into 3 groups：control group；PQ treated group：800 μmol/L PQ treated alone；preventive groups：(10，20，30)μmol/L salidroside + 800 μmol/L PQ. the cytotoxicity of PQ was measured by MTT assay，the apoptosis of PC12 cells was detected by flow cytometry，Mitochondrial membrane potential(MMP)of PC12 cells was detected by Rh123 staining，the release of LDH and the active of SOD，GSH-PX were detected by shade selection assay，CytC immunostaining were used to detect the expresion of this protein. Results：10，20，30 μmol/L Salidroside played a protective role in the damage induced by 800 μmol/L PQ for 24 h. Salidroside significantly increased the cell viability，inhibited LDH，CytC release induced by PQ. MMP collaps in preventive groups were inhibited and the active of SOD，GSH-PX were markedly enhanced. Conclusion：Salidroside can protect cells from the necrosis and apoptosis induced by PQ，The mechanism of the protective effects of Salidroside may include increasing the activation of active of SOD，GSH-PX，inhibiting the release of CytC and MMP collapse induced by PQ．

Salidroside PC12 cells Paraquat Cenapoptosis Neuroprotective

*國家自然科學基金項目(81100001)

△西安市兒童醫院(西安 710003)

紅景天苷 百草枯 細胞凋亡 PC12細胞 神經保護

R966

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.082