大骨節病、骨關節炎軟骨細胞分泌IL-1β、 TNF-α及透明質酸對其影響實驗研究*

西安交通大學醫學院第二附屬醫院骨三科(西安710004)

高宗強 郭 雄△ 陳君長 段 琛△ 馬瑋娟△ 顧其勝▲

大骨節病、骨關節炎軟骨細胞分泌IL-1β、 TNF-α及透明質酸對其影響實驗研究*

西安交通大學醫學院第二附屬醫院骨三科(西安710004)

高宗強 郭 雄△陳君長 段 琛△馬瑋娟△顧其勝▲

目的：探討在不同劑量透明質酸作用下，人大骨節病(KBD)軟骨細胞和骨關節炎(OA)軟骨細胞對IL-1β、 TNF-α合成分泌的影響，為臨床上透明質酸鈉治療OA及KBD提供實驗依據。方法：將符合臨床診斷標準的KBD及OA患者與從遭遇意外事故的病人作為正常對照，分離、體外培養三組患者關節軟骨細胞，分別給予100 μg/ml(H100組)、500μg /ml(H500組)不同劑量的透明質酸鈉(HA)干預及陰性對照(0.00 μg /ml，H0組)，通過放免測定細胞培養上清液中IL-1β、 TNF-α的含量變化。結果：與正常組比較， KBD和OA組軟骨細胞IL-1β、 TNF-α明顯增高;HA干預隨其劑量增高抑制IL-1β、 TNF-α合成增強，對TNF-α的抑制有統計學意義。結論：骨關節炎和大骨節病患者軟骨細胞合成分泌IL-1β、 TNF-α明顯增加；應用透明質酸后，可降低兩種炎性因子的分泌。

大骨節病(Kashin-beck disease，KBD)是一種慢性的地方性、變形性骨關節病，嚴重危害病區人群的健康，其發病原因及發病機制仍不確切[1]。目前的治療措施主要有更換生活用水、用糧及搬遷原有環境。對于關節疾患本身的治療，鑒于與骨關節炎有類似的癥狀和體征，因此治療也多參照骨關節炎，可以使用止痛、營養軟骨、以及關節腔注射玻璃酸鈉的治療。

對于骨關節炎患者關節腔注射透明質酸，目前在最新的關節炎治療指南中不予推薦。使得骨關節炎的治療目前面臨除了非甾體類抗炎藥外，其他無藥可用的局面。但在以往多年的臨床應用中，我們一直發現關節腔注射玻璃酸鈉對部分患者確實有效，而且，目前在臨床中，關節腔注射玻璃酸鈉仍在廣泛應用[2-4]。

現已證實,在關節退變過程中，IL-1β、 TNF-α等促炎因子有重要的作用，目前已經有針對這兩種細胞因子的抗體應用于臨床治療類分濕性關節炎及強直性脊柱炎。但體外培養的大骨節病細胞合成分泌IL-1β、 TNF-α尚無研究。對應用透明質酸后，對這兩種患者軟骨細胞合成分泌IL-1β、 TNF-α有何影響，仍屬空白。本實驗分離培養了大骨節病和骨關節炎患者的軟骨細胞，施加透明質酸干預，觀察軟骨細胞合成分泌IL-1β、 TNF-α的影響。

材料和方法

1 標本來源 大骨節病診斷依據我國大骨節病臨床診斷標準(GB16003-1995)，骨關節炎診斷依據美國風濕病協會骨關節炎診斷標準(1995年版)。將收集的所有軟骨標本分為三組：正常對照(NC)組、KBD組及OA組，每組6例。大骨節病(KBD)患者軟骨標本主要取自于行游離體摘除術后患者的游離體，患者均來自于陜西省地方病研究所，其中男3例，女3例，年齡35～47歲。骨關節炎(OA)患者關節軟骨標本均取自行全膝關節置換術者，病例均取自西安市紅會醫院，其中男3例，女3例，年齡57～73歲。正常組軟骨標本取自于因車禍等意外原因行截肢術或身亡者的新鮮膝關節軟骨，其中男4例，女2例，年齡27～39歲；取材部位主要是膝關節，均排除了遺傳性、骨性關節炎和類風濕性關節炎[5-6]。

2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養液(Hyclone公司，美國)；胰蛋白酶、透明質酸酶、Ⅱ型膠原酶(SIGMA公司，美國)；透明質酸鈉(上海其勝生物制劑有限公司，中國)；小牛血清(蘭州明海生物制品有限公司，中國)； Shel-Lable CO2培養箱(Shel-Lable公司，美國)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；Nikon雙目光學顯微鏡及纖維照相系統(日立公司，日本)[5-6]。

3 方 法

3.1 軟骨細胞的分離與培養：按文獻[5-6]方法進行原代軟骨細胞的分離與培養與傳代培養 將無菌條件下取材的軟骨切碎，分別以0.2%胰酶1h、0.1%透明質酸酶1h、0.2%II型膠原酶4h分別進行消化分離軟骨細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12(其中含青霉素、鏈霉素各100U/ml)培養液，放入含5%CO2、37°C的CO2培養箱內培養。2～3d換液1次，一般3～4周形成細胞單層。待細胞達培養瓶70%～80%后以0.25% trypsin+ 0.02% EDTA消化分離細胞進行傳代培養。

3.2 透明質酸干預：將長滿的一代細胞消化下來后按每孔20×104密度種于6孔板，每孔加含培養液2ml。每個病例種一板。在種后48h后，更換培養液，吸棄原培養液，分別加入含不同劑量HA的培養液2ml，每個6孔板分為三組，每組2孔，分別為H0(0.00μg/ml)組、H100(100μg/ml)組、H500(500μg/ml)組，培養24h后，取上清，-20℃保存。

3.3 IL-1β、 TNF-α放免檢測：將細胞培養上清液按放免試劑盒的操作說明進行放免檢測。

結 果

剛分離在培養液中懸浮未貼壁的人軟骨細胞呈球狀，已經貼壁的軟骨細胞見圖1。軟骨細胞特異性的表達II型膠原和聚集蛋白聚糖，因此我們經常也用是否表達這兩種成分來鑒定區分軟骨細胞，其中棕色的為II膠原抗體免疫組化染色結果。藍色為甲苯胺藍染色顯示聚集蛋白聚糖的結果，見圖2。IL-1β在KBD和OA組中均有升高，以OA組中升高最明顯，與正常相比，有統計學差異(P<0.05)。在補充HA干預后，可下調正常和KBD組IL-1β的分泌，在KBD組，H500能明顯下調IL-1β(P<0.05)，近乎達到正常組的水平。在OA組中，H500明顯高于H0和H100，對IL-1β調節作用差異無統計學意義，見圖3。TNF-α的含量依次為正常對照、KBD、OA。在經過HA干預后，三組TNF-α均有降低，在KBD和正常組中，隨HA劑量增大，抑制效果越明顯。在OA組，H100下調TNF-α分泌有統計學差異(P<0.05)，見圖4。

討 論

對于骨性關節炎，我們原來一直認為主要原因是因為機械壓力或磨損導致關節軟骨出現破壞。最新理論認為，骨性關節炎不單單是軟骨的退變破壞，它是包括了軟骨、滑膜、肌腱、韌帶在內的綜合性病變[7]，而且，骨關節炎越來越被認為是一種慢性炎癥性疾患[8]。

軟骨基質的正常結構和功能依賴于合成代謝和分解代謝的平衡，此平衡是通過細胞因子來調控的。根據細胞因子對代謝的調節作用特征，將其分為分解性細胞因子和合成性細胞因子，二者之間的平衡維持著軟骨基質合成代謝和分解代謝的平衡，二者之間的平衡失衡是OA軟骨基質的降解和破壞的基本原因。

分解性細胞因子中最主要的是白細胞介素-1 (IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF)。目前對于這兩種炎癥因子在關節疾患中研究最多的是類風濕性關節炎和強直性脊柱炎，且均證實了IL-1和TNF-α可與相應細胞受體結合，激活NF-κB及相關信號通路，可以誘導基質金屬蛋白酶和其他蛋白水解酶的合成并促進基質的分解代謝，是引起關節炎性病變及軟骨降解的重要因素[7, 9-10]。正因為這兩種因子在關節破壞中的重要作用，因此目前已經將腫瘤壞死因子抑制劑(TNFis)阿達木單抗、依那西普和英夫利昔單抗以及用于類風濕關節炎(RA)和強直性脊柱炎的治療[11-12]。通過基因重組技術所產生的人IL-1受體拮抗劑Anakinra也已應用于臨床。

目前研究表明，體內體外實驗均證實這兩種因子在骨關節炎中也高表達，并能促進軟骨細胞合成分泌蛋白酶，在關節退變與破壞中有重要作用[13-14]。在KBD患者中，同樣有IL-1β和TNF-α的高表達。李小迎等[15]通過對病區和對照組共216例調查后發現，成人KBD血清TNF-α和一氧化氮顯著增高，且與臨床表現變化有關。崔才磊等[16]對51例KBD患者和24例正常人血清IL-1β和TNF-α檢測后，發現患者血清IL-1β和TNF-α水平均高于正常人，而且KBD患者IL-1β和TNF-α含量存在線性相關關系。岳燕、童文森的研究結果也同樣證實了KBD患者血清和關節滑液IL-1β和TNF-α比正常人高[17-18]。

而我們的實驗結果同樣顯示了在骨關節炎及大骨節病患者的軟骨細胞合成分泌IL-1β和TNF-α是明顯增高的，這與以往的研究均一致。

既往臨床研究表明，關節腔注射透明質酸對關節退變過程中的炎性因子有很好的抑制作用。張銀剛[19]通過測量OA患者注射HA前后血清及滑液中TNF-α和IL-1β含量變化后，發現治療后TNF-α和IL-1β水平降低。HA 可能通過直接或間接調節 IL-1β和TNF-α水平，減輕繼發性炎癥反應，抑制免疫細胞增殖從而達到治療OA的目的。丁元洪等[20]分別檢測健康人及OA患者HA補充治療前后的血清及關節滑液中各細胞因子(IL - 1、IL - 6、IL - 8、TNF -α)的含量，發現OA的發病機制與關節滑膜細胞分泌過多的細胞因子以及這些細胞因子釋放入血有關。血清及關節滑液中細胞因子的檢測可作為診斷OA的重要指標之一。其次，補充HA治療可降低OA患者血清及關節滑液中細胞因子的含量，抑制OA免疫損害進程，療效肯定。補充HA治療后患者血清及關節滑液中細胞因子含量的變化可作為評價其療效的重要指標之一。

在動物實驗中也有同樣的結果。Takahash等[21]對80只實施前叉韌帶橫斷術后的新西蘭大白兔的研究中發現，使用HA治療后滑液中的金屬蛋白酶-3 (MMP-3)及白細胞介素-1β的基因表達均受到抑制。對狗萎縮的軟骨細胞進行的免疫熒光檢查中表明，使用HA治療后未發現腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及其受體，而未經HA治療組則有大量的腫瘤壞死因子-α的表達[22]。印海峰[23]以木瓜蛋白酶誘導兔OA模型，以兩種劑量玻璃酸鈉注射液給兔膝關節腔內注射，給藥5周后，玻璃酸鈉注射液關節內注射可以降低IL-1β和TNF-α的含量，同時使病變關節軟骨中蛋白聚糖和HA的含量增加，可以保護關節軟骨，對OA治療有一定作用。

許鵬等[24]應用透明質酸關節腔注射治療KBD，發現療效顯著。何長謀[25]發現KBD血清中NO、IL-1β和TNF-α含量明顯高于健康人群,在經過關節腔內注射HA后,血清IL-1β、TNF-α和NO含量明顯下降,其中IL-1β、TNF-α降至健康人群水平。

本實驗同樣證實了KBD患者和OA患者軟骨細胞IL-1β和TNF-α的含量均較正常人組高，而且體外培養的正常軟骨細胞IL-1β和TNF-α分泌量均很低，既往也有研究顯示體外培養的正常關節軟骨細胞和滑膜組織細胞只能產生微量的IL-1β，而在OA的關節液和滑膜組織細胞體外培養的上清液中都能檢測出較高水平的IL-1β，來源于OA的軟骨細胞能自發產生IL-1β[26]。這都與既往研究結果相符合。

本實驗還顯示HA可有效的抑制TNF-α的分泌，這在以往研究中得到了證實。對于HA對減低軟骨細胞合成分泌TNF-α的具體機理，以為有研究表明是通過下調NF-κB 來實現的[27]。然而具體機理，還需進一步的研究驗證。對于IL-1β，添加HA后有降低的趨勢，我們既往實驗證明了對體外培養的骨關節炎和大骨節病軟骨細胞添加透明質酸干預后，可促進II型膠原和聚集蛋白聚糖的合成和表達，并可促進細胞的增值并抑制凋亡，并有促進內源性透明質酸合成的作用[2-3]。本研究為臨床使用透明質酸治療大骨節病、骨關節病提供了一定的實驗基礎。

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(收稿：2015-03-16)

The effect of hyluronic acid on the expression of IL-1β,TNF-α in chondrocytes of Kashin-beck disease and osteoarthritis cultured in vitro

Department of Orthopedics Surgery, Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Gao Zongqiang Guo Xiong Cheng Junchang et al

Objective: To investigate the effect of HA on the expression of IL-1β,TNF-α in KBD and OA chondrocytes cultured in vitro to understand the effect and mechanism of HA on the treatment for KBD and OA. Method: We selected the articule cartilage sample of KBD and OA patients according to clinical diagnosis for KBD and OA. Chondrocytes of KBD, OA and normal control were separated and cultured in vitro . Then varying dosages of HA were administered to chondrocytes,100 μg/ml(H100 group)、500μg /ml(H500 group)and negative control(0.00 μg /ml，H0 group),and the expression of IL-1β, TNF-α were detected by means of radio-immunologic analysis.Result: Compared with normal control group, the IL-1β,TNF-α were higher in KBD and OA.after administed with HA, the expression of IL-1β,TNF-α were decreasing accordingly. there is no stastic signifcance in TNF-α expression.Conclusion: IL-1β,TNF-α were higher in KBD and OA, and the HA have the tendcency to decrease the expression of IL-1β,TNF-α.

Hyaluronic acid Kashin-beck disease Osteoarthritis Chondrocytes Interleukin-lbeta Tumor necrosis factor-alpha

國家自然科學基金重點資助項目(30630058)

陜西省社會發展公關資助項目(2013SF2-10)

郭 雄

透明質酸 大骨節病 骨關節炎 軟骨細胞 白細胞介素-1β 腫瘤壞死因子-α

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.002

*科技部國際合作重點專項(2006DFA33610)

△西安交通大學醫學院公共衛生系地方病研究所、環境與疾病相 關基因教育部重點實驗室

▲上海其勝生物制劑有限公司