抗菌藥物對LPS誘導雞肝細胞損傷的影響及復方甘草酸單胺的修復效應

劉騰飛，田 靜，耿智霞，李會敏，余祖功

(南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

抗菌藥物對LPS誘導雞肝細胞損傷的影響及復方甘草酸單胺的修復效應

劉騰飛，田 靜，耿智霞，李會敏，余祖功*

(南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

旨在探索LPS誘導雞肝細胞損傷過程中抗菌藥物的影響及復方甘草酸單胺(CAG)的修復作用。選用半原位灌流法分離雞肝細胞，原代培養48 h，篩選LPS最佳致肝細胞損傷劑量；固定其最佳致損半量，并添加不同質量濃度的恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林，觀察致損效果；LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)致損24 h，給予不同濃度CAG，檢測細胞存活率及ALT、AST、SOD、GSH、MDA活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果表明，LPS ≤ 50 μg·mL-1，肝細胞損傷不明顯，LPS ≥ 60 μg·mL-1，肝細胞存活率極顯著降低(P<0.01)，ALT、AST活性極顯著升高(P<0.01)。LPS(30 μg·mL-1)各組隨恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林添加量增加，肝細胞損傷程度相應加大，LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+氟苯尼考(40 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+阿莫西林(60 μg·mL-1)可達肝細胞損傷標準。CAG劑量依賴性(25、50、100、200、400 μg·mL-1)抑制LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)引起的ALT、AST、MDA活性和肝細胞早期凋亡比率的升高，提高SOD、GSH及肝細胞存活率。結果提示，LPS可致肝細胞損傷；抗菌藥物使LPS更易誘發肝損傷；CAG通過抗氧化，并抑制細胞凋亡對雞肝細胞發揮保護作用。

LPS；恩諾沙星；氟苯尼考；阿莫西林；復合式肝細胞損傷；復方甘草酸單胺

家禽集約化趨勢明顯，受困于養殖密度與環境，大腸桿菌、沙門菌等感染多發，抗菌藥物廣為使用。諸多類抗菌藥物在殺菌的同時，會促進內毒素釋放，以阿莫西林、頭孢類、氟喹諾酮類、氟苯尼考等報道促釋明顯[1-2]。內毒素即革蘭陰性菌細胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，細菌裂解或黏附其他細胞時釋放，過量LPS進入血液，導致肝損傷[3]。

獸醫臨床病雞肝損傷癥狀多見，LPS作用明確[3]。抗菌藥物使用與存在是否影響LPS致肝損傷的發生、病理及轉歸等未見報道。作者采用體外雞原代肝細胞培養的方法，探索恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林等對LPS致肝細胞損傷的影響，并研究復方甘草酸單胺(CAG)對該復合損傷的保護效應及機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

40～50日齡健康海藍公雞，購自南京湯泉雞場，體重(1.5±0.2) kg。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林(≥99.0%)，浙江國邦藥業有限公司。CAG，實驗室自制，每100 g含甘草酸單胺2.8 g(西安富捷藥業有限公司)，甘氨酸和蛋氨酸各2 g(南寧贏創藥業有限公司)。膠原酶(Ⅳ型)、牛胰島素、MTT、內毒素(LPS)、Williams′ medium E培養液(Sigma公司)，胎牛血清、青鏈霉素(雙抗)(Gibco公司)，Annexin V-FITC/PI(Ebioscience公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、微量還原性谷胱甘肽(GSH)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及門冬氨酸氨基轉移酶(AST)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。流式細胞儀(Facscalibur，BD Bioscience)，全自動酶標儀和分光光度計(iMark和SmartSpec3000，Bio-Rad)。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞肝細胞分離 在P.O.Seglen[4]兩步法的基礎上改進，翅靜脈注射肝素鈉(1 750 IU·kg-1)抗凝，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉供試雞。無菌打開腹腔，結扎腸系膜總靜脈、胰十二指腸靜脈和腺胃脾靜脈，肝門靜脈插管，打開前腔靜脈，37 ℃沖洗液A(33 mmol·L-1HEPES，127.8 mmol·L-1NaCl，3.15 mmol·L-1KCl，0.7 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，0.6 mmol·L-1EGTA，pH 7.6)沖洗。然后，37 ℃沖洗液B(33 mmol·L-1HEPES，127.8 mmol·L-1NaCl，3.15 mmol·L-1KCl，0.7 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，3 mmol·L-1CaCl2)沖洗。將肝轉移到無菌燒杯中，37 ℃ 100 mL 0.5% Ⅳ型膠原酶循環灌注20～25 min，流速約為20 mL·min-1。撕開肝包膜，D-Hanks洗脫肝細胞，100、200目濾網過濾，500 r·min-1離心3 min，棄上清，重復2次。生長培養基(含10%胎牛血清，2%雙抗，0.5 mg·L-1牛胰島素的Williams' medium E培養液)重懸細胞。

1.3.2 肝細胞培養 臺盼藍活細胞計數>95%，調整細胞濃度以5×105·mL-1接種于細胞培養板，37 ℃、5% CO2、飽和濕度靜置培養。細胞48～144 h處于生長穩定期，可用于試驗。

1.3.3 LPS致肝細胞損傷試驗分組 取正常培養48 h的肝細胞分2組(n=6)，對照組：用生長培養液換液；LPS組：分別用含10、20、30、40、50、60、80、100 μg·mL-1LPS的生長培養液換液，繼續培養24 h。

1.3.4 LPS聯合恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林致肝細胞損傷試驗分組 取正常培養48 h的肝細胞分4組(n=6)，對照組：用生長培養液換液；LPS+恩諾沙星組：分別用含30+20、30+40、30+60、30+80、30+100 μg·mL-1LPS+恩諾沙星的生長培養液換液；LPS+氟苯尼考組：分別用含30+20、30+40、30+60、30+80、30+100 μg·mL-1LPS+氟苯尼考的生長培養液換液；LPS+阿莫西林組：分別用含30+20、30+40、30+60、30+80、30+100 μg·mL-1LPS+阿莫西林的生長培養液換液，繼續培養24 h。

1.3.5 CAG對肝細胞保護作用試驗分組 取正常培養48 h肝細胞分3組(n=6)，對照組：生長培養液換液，繼續培養24 h；模型組：含 LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)的生長培養液換液，繼續培養24 h；CAG組：含 LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)的生長培養液培養24 h后，用含CAG質量濃度為25、50、100、200、400 μg·mL-1的生長培養液換液，繼續培養24 h。1.3.6 MTT法測定細胞活率 各組終止培養前加入20 μL MTT(5 g·L-1)，37 ℃，5% CO2孵育4 h。棄去上清液，每孔內加入 DMSO 150 μL，靜置10 min。在酶標儀 570 nm 下測定各孔吸光度值，細胞相對存活率=(OD試驗孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)×100%，OD=(optical density)。1.3.7 細胞酶學指標檢測 細胞上清液丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)；細胞勻漿液超氧化物歧化酶(SOD)、微量還原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)活力或含量均由酶標儀檢測，按試劑盒說明操作。

1.3.8 肝細胞凋亡檢測 按Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明操作，在南京農業大學細胞形態儀器室由流式細胞儀檢測。

1.4 數據處理

所得數據使用統計學軟件SPSS 19.0 進行分析。

2 結 果

2.1 LPS對肝細胞上清液中ALT、AST活性及存活率影響

由表1所示，隨LPS濃度增加，ALT、AST釋放度與肝細胞存活率呈劑量依賴性上升和降低。與對照組相比，LPS質量濃度≥50 μg·mL-1時ALT、AST升高極顯著(P<0.01)；LPS質量濃度為60 μg·mL-1，細胞存活率為48.19%±2.56%，該質量濃度處理下細胞存活率與ALT、AST釋放度均較為適宜，適合作為LPS誘導肝細胞損傷最佳劑量。

組別GroupALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)細胞存活率/%Cellviability(%)對照組Controlgroup36.33±6.6665.02±9.01100LPS(10μg·mL-1)43.54±5.0964.41±11.8893.27±2.37LPS(20μg·mL-1)49.37±3.60*61.68±8.5090.75±1.86LPS(30μg·mL-1)52.21±2.72*71.68±11.1280.30±2.09LPS(40μg·mL-1)67.26±6.92**87.09±11.02*73.53±3.49LPS(50μg·mL-1)79.03±2.59**113.50±11.27**61.12±5.01LPS(60μg·mL-1)91.72±9.45**138.50±9.29**48.19±2.56LPS(80μg·mL-1)96.87±11.25**155.40±22.60**25.70±3.14LPS(100μg·mL-1)108.70±8.99**142.5±10.59**12.00±2.65

與對照組比較*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組比較#.P<0.05，##.P<0.01，下表同*.P<0.05，**.P<0.01，compared to control group；#.P<0.05，##.P<0.01，compared to model group，the same as below

2.2 LPS聯合恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林對肝細胞培養上清液中ALT、AST活性及存活率影響

由表2所示，隨LPS中添加的恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林質量濃度的增加，肝細胞損傷程度相應加大。其中LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+氟苯尼考(40 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+阿莫西林(60 μg·mL-1)使肝細胞存活率下降50%，ALT、AST活性極顯著升高(P<0.01)，故確定以上組合質量濃度作為新型復合式肝細胞損傷最佳造模劑量。

組別GroupALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)細胞存活率/%Cellviability(%)對照組Controlgroup36.33±6.6665.02±9.01100LPS(30μg·mL-1)+ENR(20μg·mL-1)55.07±6.61*80.53±10.4379.31±2.19LPS(30μg·mL-1)+ENR(40μg·mL-1)68.45±7.67**90.93±10.50*68.85±2.22LPS(30μg·mL-1)+ENR(60μg·mL-1)92.47±9.23**111.00±14.40**65.93±1.93LPS(30μg·mL-1)+ENR(80μg·mL-1)109.70±4.79**126.60±1039**52.68±2.31LPS(30μg·mL-1)+ENR(100μg·mL-1)113.30±14.70**127.20±8.43**25.80±1.52LPS(30μg·mL-1)+FFC(20μg·mL-1)65.07±3.39**98.20±7.96**69.24±4.32LPS(30μg·mL-1)+FFC(40μg·mL-1)76.11±3.97**107.60±12.25**53.18±2.34LPS(30μg·mL-1)+FFC(60μg·mL-1)95.80±7.18**117.62±4.86**42.59±4.01LPS(30μg·mL-1)+FFC(80μg·mL-1)109.70±7.04**130.00±5.41**32.68±3.21LPS(30μg·mL-1)+FFC(100μg·mL-1)114.60±17.17**130.54±9.16**19.13±2.07LPS(30μg·mL-1)+AML(20μg·mL-1)66.41±3.48**78.20±10.45*72.18±1.60LPS(30μg·mL-1)+AML(40μg·mL-1)75.78±2.89**97.59±5.11**60.93±4.77LPS(30μg·mL-1)+AML(60μg·mL-1)97.14±7.15**104.30±10.94**49.34±3.29LPS(30μg·mL-1)+AML(80μg·mL-1)113.54±6.06**123.30±6.53**22.47±2.63LPS(30μg·mL-1)+AML(100μg·mL-1)111.63±15.58**133.90±3.42**20.11±1.45

2.3 CAG對肝細胞培養上清液中ALT、AST活性及存活率影響

由表3所示，與對照組比較，模型組細胞培養上清液中ALT、AST活性極顯著上升(P<0.01)，顯示肝細胞受損明顯；與模型組相比，CAG各質量濃度處理均對肝細胞有保護作用，其中100、200、400 μg·mL-1CAG處理組極顯著抑制2種酶的溢出量(P<0.01)。細胞存活率測定結果表明，與對照組比較，模型組細胞存活率極顯著下降(P<0.01)，為49.33%±3.09%；與模型組相比，CAG組細胞存活率均極顯著升高(P<0.01)，其中200、400 μg·mL-1CAG處理組細胞存活率較高，分別為87.68%±2.85%、90.45%±2.51%。

組別GroupALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)細胞存活率/%Cellviability(%)對照組Controlgroup36.33±6.6665.02±9.01100模型組Modelgroup98.62±10.39**153.06±16.45**49.33±3.09**CAGⅠ(25μg·mL-1)90.09±7.20133.00±18.9057.80±1.89##CAGⅡ(50μg·mL-1)81.41±8.00#117.65±12.44##70.55±0.84##CAGⅢ(100μg·mL-1)69.70±7.70##95.51±9.88##79.24±1.10##CAGⅣ(200μg·mL-1)55.32±9.03##80.77±8.88##87.68±2.85##CAGⅤ(400μg·mL-1)48.85±10.21##74.91±6.75##90.45±2.51##

2.4 CAG對肝細胞中SOD、GSH、MDA活性或含量影響

表4結果顯示，與對照組比較，模型組SOD、GSH、MDA活性下降極顯著(P<0.01)；與模型組相比，CAG組各個劑量均能提高SOD、GSH、MDA活性，其中200、400 μg·mL-1CAG處理組極顯著升高SOD活性(P<0.01)；100 μg·mL-1CAG處理組可極顯著升高GSH含量(P<0.01)；100、200、400 μg·mL-1CAG處理組可有效抑制肝細胞MDA生成(P<0.01)。

組別GroupSOD/(U·mg-1)GSH/(nmol·mg-1)MDA/(nmol·mg-1)對照組Controlgroup81.09±9.96117.30±15.346.33±1.55模型組Modelgroup30.57±8.66**58.04±12.51**17.19±1.96**CAGⅠ(25μg·mL-1)33.34±9.1572.50±10.0116.40±1.89CAGⅡ(50μg·mL-1)41.46±10.9570.47±12.0513.53±1.82#CAGⅢ(100μg·mL-1)49.26±8.32#87.91±13.90##12.43±2.46##CAGⅣ(200μg·mL-1)59.38±8.90##82.07±10.61#12.00±1.28##CAGⅤ(400μg·mL-1)67.51±8.15##85.62±8.63#10.2±51.59##

2.5 CAG對肝細胞凋亡率影響

Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率結果表明，模型組早期凋亡細胞比例為71.32%±7.59%，與對照組3.57%±1.23%相比極顯著增加(P<0.01)；CAG 50，100，200，400 μg·mL-1處理后，早期凋亡比例分別降至41.43%±2.98%，29.38%±5.24%，13.97%±2.33%和12.35%±1.98%，與模型組相比有極顯著差異(P<0.01)。具體數值見圖1與表5。

組別Group細胞早期凋亡率/%Earlyapoptosisrate對照組Controlgroup3.57±1.23模型組Modelgroup71.32±7.59**CAGⅠ(25μg·mL-1)68.12±5.03CAGⅡ(50μg·mL-1)41.43±2.98##CAGⅢ(100μg·mL-1)29.38±5.24##CAGⅣ(200μg·mL-1)13.97±2.33##CAGⅤ(400μg·mL-1)12.35±1.98##

3 討 論

3.1 雞肝細胞分離及LPS誘發肝細胞損傷

肝細胞分離與原代培養是研究肝細胞功能的有效方法。本試驗在P.O.Seglen[4]兩步法的基礎上改進，即在體內進行第一步灌流，保留門靜脈完整分離肝后，在體外完成膠原酶循環灌流。本法節約了膠原酶使用量，細胞分離徹底且損傷較小，且不需要特殊設備，既能滿足試驗要求，又經濟簡便，適合普通實驗室使用。

在雞原代肝細胞培養中，隨加入LPS質量濃度增大，發現ALT、AST的釋放度與肝細胞死亡率不斷增加。ALT主要存在肝細胞質內，AST主要存在肝細胞的線粒體內，肝細胞受損時，二者釋放增加，故檢測細胞培養上清液中其活性升高[5]。結果證實不同劑量的LPS均可不同程度的誘發肝細胞損傷，當用60 μg·mL-1LPS處理時，細胞存活率下降50%左右，ALT、AST的釋放度極顯著升高，故將此質量濃度作為LPS誘導肝細胞損傷的最佳劑量。

3.2 LPS致雞肝細胞損傷中恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林的協同效應

選用LPS最佳致肝細胞損傷半量(30 μg·mL-1)，分別添加恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林，發現不同劑量的恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林均可使LPS在該劑量下的致肝細胞損傷程度加重，以LPS(30 μg·mL-1)聯合恩諾沙星(80 μg·mL-1)、氟苯尼考(40 μg·mL-1)、阿莫西林(60 μg·mL-1)處理肝細胞，細胞存活率下降達50%左右，ALT、AST釋放極顯著增加。提示添加殺菌性抗菌藥物，促使LPS致肝細胞損傷劑量下降，殺菌性抗菌藥物使LPS更易誘發肝損傷。在本研究已證實，阿莫西林、氟苯尼考、氟喹諾酮類藥物在殺菌的同時可促進大腸桿菌LPS的釋放[6-8]。殺菌性藥物在促進LPS釋放同時又能協同LPS致肝損傷，可能進一步增加了家禽肝炎癥狀的發生率及危害程度。醫學臨床也已報道，殺菌性藥物(如阿莫西林、頭孢類、氟喹諾酮類、酰胺醇類藥物)也可誘發藥物性肝損傷[9-11]。LPS與抗菌藥物致肝損傷間相互影響與作用值得進一步探究。

A. 對照組；B. 模型組； C. CAG(25 μg·mL-1)； D. CAG(50 μg·mL-1)；E. CAG(100 μg·mL-1)； F. CAG(200 μg·mL-1)；G. CAG(400 μg·mL-1)A. Control group; B. Model group; C. CAG (25 μg·mL-1); D. CAG (50 μg·mL-1); E. CAG (100 μg·mL-1); F. CAG (200 μg·mL-1); G. CAG (400 μg·mL-1)圖1 CAG對肝細胞凋亡率影響 Fig.1 Effects of CAG on apoptosis rate of hepatocytes

已報道，添加卡介苗或與D-半乳糖胺可致LPS致肝損傷的劑量降低[12-14]，也即“復合式肝細胞損傷模型”。本文結果顯示，不同劑量的抗菌藥物，同樣使LPS致肝細胞損傷劑量降低。該新型復合式肝細胞損傷模型，為進一步研究家禽肝損傷病理機制及獸醫臨床護肝藥物的研發奠定基礎。

3.3 CAG對LPS聯合恩諾沙星誘發肝細胞損傷的修復作用

在LPS聯合恩諾沙星致肝細胞損傷中，添加不同質量濃度的CAG，可顯著抑制細胞死亡率與細胞培養上清液ALT、AST活性上升，表明CAG對肝細胞有一定的保護作用，其作用強度與用量有關。

CAG主要由甘草酸單胺、甘氨酸和蛋氨酸組成[15]，為醫學臨床應用廣泛的護肝藥物。N.P.Visavadiya 等[16]證實CAG通過抑制脂質過氧化反應，增強機體自由基清除能力，對抗自由基對肝的損傷。本試驗中，模型組肝細胞中MDA含量顯著增加，SOD活性和GSH含量顯著下降，表明LPS聯合恩諾沙星可促使肝細胞的脂質過氧化反應，損害機體氧化自由基清除系統，加重肝細胞損傷；CAG可不同程度抑制MDA的生成，提高SOD活性和GSH含量，顯示CAG可抑制肝細胞脂質過氧化反應，保持SOD活性，抑制GSH的耗竭，增強機體的抗氧化能力。

肝細胞凋亡是肝細胞損傷機制的一個重要方面。動物試驗研究表明，LPS致肝損傷過程中可導致肝細胞凋亡顯著增加[17]，CAG可抑制CCl4引起的大鼠肝細胞凋亡的增加[18]。本試驗中，模型組肝細胞中早期凋亡率極顯著升高，表明LPS聯合恩諾沙星可通過增加細胞早期凋亡率加重肝細胞損傷；CAG可劑量依賴性抑制LPS聯合恩諾沙星引起的早期凋亡率增加，由此可知CAG對雞肝細胞保護作用與其抗凋亡能力相關。

4 結 論

LPS可致肝細胞損傷，恩諾沙星、氟苯尼考及阿莫西林等抗菌藥物的存在，均使LPS致肝細胞損傷劑量下降，顯示藥物與LPS間致肝損傷有協同效應。CAG具有提高細胞存活率，影響細胞SOD、GSH、MDA活性或含量，抑制凋亡等修復效應。本研究結果啟示，家禽養殖實踐中，應合理使用殺菌性藥物，規范其使用方案，以免其和內毒素相互協同誘發和加重肝損傷，影響疾病愈合及家禽生長。

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(編輯 白永平)

Effects of Antibiotics on LPS Induced Liver Cell Injury and Hepatoprotective Activity of Compound Ammonium Glycyrrhizin

LIU Teng-fei，TIAN Jing，GENG Zhi-xia，LI Hui-min，YU Zu-gong*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

The present study was aimed at the effects of antibiotics on LPS induced liver cell injury and hepatoprotective activity of compound ammonium glycyrrhizin (CAG).Chicken hepatocytes were isolated by semi-situperfusion method.After the cells were cultured for 48 h，LPS was added with different concentrations to screen the optimal dose of liver cell injury.At the half of the optimal dose of LPS，enrofloxacin，florfenicol and amoxicillin were added with different concentration to detect the indexes of liver cell injury.Hepatocytes were treated with different concentrations of CAG for 24 h after the addition of LPS (30 μg·mL-1) + enrofloxacin (80 μg·mL-1).Cell viability and activities of ALT，AST，SOD，GSH，MDA were measured，flow cytometric analysis was conducted to detect the early apoptosis ratio of hepatocytes.The result showed that when LPS less than 50 μg·mL-1，the liver injury was not obvious.While LPS at more than 60 μg·mL-1，the cell viability were significantly lower and the activities of ALT，AST in the culture media were significantly higher than those of controls(P<0.01).LPS (30 μg·mL-1) combined with enrofloxacin (80 μg·mL-1)，florfenicol (40 μg·mL-1)，amoxicillin (60 μg·mL-1) could induce liver cell injury significantly.CAG (25，50，100，200，400 μg·mL-1) could markedly reduce the numbers of early apoptotic cells，inhibit the elevation of ALT，AST，MDA，and significantly increase the reduced level of SOD，GSH and cell viability.These results indicated that LPS could induce liver cell injury.Antibiotics might contribute to the liver cell injury induced by LPS.CAG counteracts liver cell injury at various levels by preventing apoptosis and oxidative stress damage.

LPS；enrofloxacin；florfenicol；amoxicillin；complex chicken liver cells injury；compound ammonium glycyrrhizin

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.019

2014-08-27

劉騰飛(1988-)，男，河南博愛人，碩士，主要從事新獸藥研發工作，E-mail：2011107030@njau.edu.cn

*通信作者：余祖功，E-mail：yuzugong@njau.edu.cn

S859.7

A

0366-6964(2015)02-0309-08