豬SOCS4基因的克隆、生物信息學分析及熱應激條件下的表達

王 萍，巨向紅，雍艷紅，賈汝敏，馬銘龍，趙云濤，廖 明

(1.廣東海洋大學動物科學系，湛江 524088； 2.廣東海洋大學動物醫學系，湛江 524088；3.農業部動物疫病防控重點開放實驗室，廣州 510642； 4.廣東海洋大學現代生化中心，湛江 524088；

5.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

豬SOCS4基因的克隆、生物信息學分析及熱應激條件下的表達

王 萍1，巨向紅2,3，5*，雍艷紅2，賈汝敏1，馬銘龍1，趙云濤4，廖 明3，5

(1.廣東海洋大學動物科學系，湛江 524088； 2.廣東海洋大學動物醫學系，湛江 524088；3.農業部動物疫病防控重點開放實驗室，廣州 510642； 4.廣東海洋大學現代生化中心，湛江 524088；

5.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

旨在研究和系統闡述熱應激誘發豬免疫抑制及炎性因子紊亂的發生機理。本研究克隆了土雜(陸川豬×長白豬)豬SOCS4基因，發現其開放閱讀框(ORF)長1 326 bp，編碼441個氨基酸，N端包含285個氨基酸，與長白豬、牛、山羊、貓、馬、犬、人和小鼠的氨基酸序列同源性分別為100.0%、96.1%、96.1%、95.2%、94.6%、94.3%、93.0%和88.1%；蛋白分子量為50.5 ku，等電點(PI)為6.60。熒光定量PCR結果顯示，高溫條件下，第3和第9天胸腺組織上SOCS4 mRNA顯著上調表達(P≤0.05)，而在第1和第6天的腸系膜淋巴結中極顯著上調表達(P≤0.01)。與上述組織不同，SOCS4 mRNA在小腸和脾組織中卻顯著下調表達(P≤0.05)。本研究成功克隆了土雜豬SOCS4基因，發現其在高溫條件下的表達量發生明顯改變，并呈組織和時間依賴性。

豬;SOCS4;克隆;熒光定量;熱應激

熱應激已成為我國南方地區應激性致病因素中危害最大的一種，給養殖業造成了巨大的經濟損失[1]。其使豬的生長速度下降、料耗增加和免疫能力降低[2-3]，從而對各類傳染性疫病的敏感性增高[4]。課題組前期的研究發現，熱應激破壞豬T淋巴細胞亞群平衡、上調Toll樣受體(TLR)2、TLR4和TLR4選擇性剪切體的表達，而炎性因子IL-2、IFN-γ和IL-12的表達也發生改變，出現明顯的炎性因子紊亂現象[3，5-9]。系統闡述這些現象發生的分子機理是熱應激防控的關鍵。

細胞因子信號傳導抑制因子(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)是一類胞內受體信號調節因子，參與信號傳導的負向調控，是炎癥反應和免疫應答中重要的調控蛋白[10-11]。目前已發現的SOCS家族成員有8種，分別為SOCS1-7和CIS[12]。該家族成員之間結構相似，均具有中央SH2區和C末端的SOCS box區，因N末端的長度不一而功能各異[13]。研究發現，在SOCS家族中，僅SOCS1和SOCS3的N末端具有特異的保守KIR區，該結構具有阻斷JAKs催化位點從而抑制其活性的功能[14-15]。另外，盡管同家族中的SOCS4、SOCS5、SOCS6和SOCS7均具有較長的N末端，但僅SOCS4和SOCS5的N末端存在一段保守區(N-terminal conserved region，NTCR4-5)[16]。

據報道，SOCS4不僅在顆粒細胞分化過程中發揮負向調節功能，參與卵泡的發育調控[17-18]， 還在調節表皮生長因子受體(Epidermal growth factor，EGF)[19]和IL-4[20]受體的相互作用上扮演重要的作用。但目前有關SOCS4在免疫調控中的作用及其N端NTCR4-5保守區的功能研究報道鮮見。探討應激條件下SOCS4在中樞免疫系統和黏膜免疫系統中的表達規律，可能有助于闡述其在熱應激致病過程中的作用機理。鑒于此，本研究以對熱帶亞熱帶氣候條件下有較強適應性的本地土雜豬(陸川豬×長白豬)為研究對象，克隆SOCS4基因，分析其結構特征，研究其在熱應激豬的胸腺、脾、腸系膜淋巴結和小腸組織中的表達變化，為進一步闡述SOCS4 N末端功能和系統闡述SOCS4在應激誘發豬免疫抑制中的調控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 試驗動物 15頭3～4月齡健康去勢土雜豬(長白豬×陸川豬)購自湛江某豬場，體重40 kg左右。飼養于人工氣候溫室中(環境溫度：(35±1)℃)，24 h不間斷供熱。受試豬自由飲水，每日飼喂3次，早、中、晚各1次。飼養標準參照其他豬種。

1.1.2 主要試劑 Trizol、 Sample Protector、 pMD18-T載體、 ExTaq Mix酶、 DEPC、 DNA Marker DL-2000、 6×loading Buffer、 PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA(gDNA) Synthesis Kit、SYBR@Prime Script RT-PCT Kit II均購自TaKaRa公司。Plasmid Mini Kit I、 Gel Extraction Kit購自OMEGA公司。瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購于OXOID公司。氨芐青霉素購自上海生工生物工程公司。大腸桿菌工程菌DH5α為本實驗室保存。Gold View核酸染料購自賽百盛公司。其他國產分析純試劑均購自廣州化學制劑廠。

1.1.3 主要儀器 臺式高速冷凍離心機(美國Sigma公司)。梯度PCR儀、 水平電泳槽、 Chromo 4熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。BioPhotometer plus核酸蛋白分析儀(德國Eppendorf公司)，超低溫冰箱(日本三洋)，GDS-800凝膠成像系統(美國UPV公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 分別在高溫處理開始后的第0、1、3、6和9天屠宰受試豬，每個時間點3頭。分別采取脾、胸腺、空腸和小腸等組織，液氮速凍后存于-80 ℃低溫冰箱，用于qRT-PCR。基因克隆所用樣品與試驗對照組樣品均采自第0天的受試豬。

1.2.2 引物設計 根據GenBank登錄的豬SOCS4基因序列(HM565936.1)和GAPDH基因序列(AF017079.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設計擴增引物和熒光定量PCR引物(表1)，設計好的引物交由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

劉蜀貝在《比較文學：語文教學應有的開放視野》一文中指出，“比較文學作為研究文學的一種理念和方法，在中學語文教學中的普及和應用，對當前的語文教學改革有著非常積極的影響”。[9]具體到教學實踐，他認為：

表1 PCR引物序列

Table 1 PCR primers used in present study

引物名稱Name引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm大小/bpSize用途PurposeSOCS4F:ATCCAGAAGAAATATCCTACTGR:CTAGCATTGTTGTTCTGGTG591400克隆SOCS4F:CAGTTACTCGGACAGCCCTAGTR:CTGTGGCCACAGGAATGATCTA58156定量GAPDHF:GAAGGTCGGAGTGAACGGATR:GGGTAGAATCATACTGGAACA58149定量

1.2.3 RNA提取 TRIZOL法提取各組織總RNA,具體步驟按照試劑盒說明書進行。提取的總RNA用DEPC水充分溶解，-70 ℃保存備用。

1.2.4 RT-PCR

1.2.4.1 目的片段的擴增：根據PrimeScript反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成，具體步驟按說明書進行。擴增體系(50 μL)：cDNA溶液2.0 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，下游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，Master Mix(2×)25 μL，dH2O 21 μL。擴增參數： 94 ℃預變性3 min； 94 ℃變性30 s， 退火30 s， 72 ℃延伸1 min，40個循環； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存產物。

1.2.4.2 產物回收與轉化：產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gel Extraction Kit回收目的片段，將回收的目的片段與pMD18-T載體連接(參考說明書)，后轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞涂布于預先加入Amp的LB瓊脂平板，37 ℃過夜。

1.2.4.3 重組質粒鑒定與測序：挑選白色單菌落接種于10 μL LB液體培養基，參照以上反應條件，取1 μL菌液作為模板進行PCR擴增，檢測結果為陽性時，將剩余9 μL接種于加有Amp(100 μg·μL-1)的10 mL LB液體培養基中，37 ℃ 160 r·min-1振蕩培養13～16 h。按照Plasmid Mini Kit I說明書抽提質粒，陽性重組質粒送往英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。

1.2.4.4 生物信息學分析：利用NCBI在線ORF Finder軟件查找豬SOCS4開放閱讀框，利用DNAStar軟件翻譯ORF核苷酸序列，用Clustal X1.81軟件與GenBank上已發表的長白豬、人、小鼠和牛SOCS4的氨基酸序列進行同源性比較，并用Box Shade作圖。Predictprotein(http://www.predictprotein.org/)預測SOCS4蛋白質二級結構，ESyPred3D Web Server 1.0同源建模預測SOCS4三維結構；通過ExpAsy的Protscale程序計算疏水性；通過NCBI CDD在線預測保守結構域；TargetP 1.1 Server軟件預測亞細胞定位。

1.2.5 熒光定量PCR 熒光定量反應體系：10.0 μL SYBR Premix Ex Taq II (2×)，0.4 μL上游引物(20 μmol·L-1)，0.4 μL下游引物(20 μmol·L-1)，2.0 μL cDNA模板，7.2 μL ddH2O。反應條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。每個循環后對體系中熒光信號進行檢測。采用相對定量，用2-ΔΔCt法來計算SOCS4在各個組織的表達量，用SPASS軟件進行顯著性分析。將所得數據與第0天對照組經過歸一化處理，處理組以對照組的倍數表示并作圖。

2 結 果

2.1 豬SOCS4基因的克隆

2.2 豬SOCS4基因序列特征

克隆得到土雜豬SOCS4 ORF全長1 326 bp，編碼441個氨基酸，蛋白分子量為50.5 ku，等電點(PI)6.60。NCBI在線CDD蛋白結構分析軟件檢測結果顯示，克隆序列完整，具有SOCS家族特有的保守結構域SH2區與SOCS box區(圖2)。不同物種氨基酸序列對比發現，SOCS4 N末端存在一段保守序列mSOCS470-151(圖3黃色區域)。

圖1 SOCS4質粒 PCR電泳圖Fig.1 The electrophoresis result of PCR product of SOCS4 plasmid

2.3 豬SOCS4基因同源性分析

利用DNAMAN軟件中的多序列比對程序，將測序結果與長白豬(HM565936.1)、牛(NM_001076218.2)、山羊(XM_005685884.1)、貓(XM_004001462.1)、馬(XM_005605169.1)、犬(XM_003435136.3)、人(NM_199421.1)和小鼠(BC_117814.1)進行同源性比對，分析結果顯示分別為100.0%、96.1%、96.1%、95.2%、94.6%、94.3%、93.0%和88.1%(表2)。

對不同物種SOCS4氨基酸序列遺傳距離進行計算，發現本地土雜豬與長白豬遺傳距離為0，與牛、羊距離次之，為0.039，而與小鼠最遠，為0.119。

2.4 疏水性分析

利用ExpAsy的Protscale程序計算豬SOCS4的疏水性并作圖(圖4)。可見SOCS4蛋白在275、276和374位疏水性最強。同時存在兩個明顯的親水區，在247位親水性最強。

圖2 SOCS4保守結構域Fig.2 The conserved domain region of SOCS4

表2 土雜豬SOCS4氨基酸序列與其他動物的同源性比較

Table 2 The identical alignment of amino acid sequence of TZ pig SOCS4 compared with other animals

%

圖中綠、紅、黃色區域分別代表SOCS box、SH2和N末端保守域1(NTCR4-5).1.LKQKLQDAVG；2.HISELM；3.DLAFRWHFIKR)Regions marked with green，red and yellow displayed the SOCS box，SH2 and N-terminal conserved region 1(NTCR4-5).1.LKQKLQDAVG；2.HISELM；3.DLAFRWHFIKR)，respectively圖3 SOCS4在本地土雜豬與幾種哺乳動物間的氨基酸序列同源對比圖Fig.3 Identical alignment of the amino acid sequence of the local TZ pig with the corresponding parts of cattle(NM_001076218.2)，human(NM_199421.1) and mouse(BC117814.1) SOCS4 proteins

2.5 亞細胞定位

TargetP1.1預測結果表明，SOCS4蛋白非葉綠體轉運肽(Chloroplast transit peptide，cTP)和線粒體導肽(Mitochondrial targeting peptide，mTP)，也不是分泌通道信號肽(Secretory pathway signal peptide，SP，圖5)。

2.6 二級結構與三維結構分析

Predictprotein(http://www.predictprotein.org/)預測結果表明，SOCS4氨基酸殘基由9.75%的α-螺旋，7.03%的β-折疊，和83.22%的無規卷曲組成。

將克隆序列所編碼氨基酸序列提交到ESyPred3D Web Server 1.0(http://www.unamur.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred/)，同源建模結果顯示SOCS4約由5個α-螺旋、多個β-折疊、轉角以及無規卷曲組成(圖6)。

Y軸為親水指數：正數時表示疏水，數值越大，疏水越強；負數時表示親水，數值越小親水越強。X軸為SOCS4蛋白質各個氨基酸位置Y-axis displayed the hydrophilic index：a positive number indicates a hydrophobicity，the greater of the value indicated the more of hydrophobic；negative number indicates hydrophilic，the smaller of the value indicated the stronger of hydrophilic.X-axis displayed the positions of SOCS4 amino acids圖4 豬SOCS4蛋白疏水性Fig.4 The hydrophobicity profile of pig SOCS4 protein

Len.氨基酸長度；Loc.基于mTP、SP和other 3項分數的高低對蛋白質葉細胞定位進行預測； -.代表其他；RC.可靠性評測值，分數由高到底分為1～5級，分數越低，預測越可靠Len.Sequence length；Loc.PredI:Ction of localization based on the scores of mTP，SP and other；-.Any other location；RC.Reliability class，scores from high in the end is divided into 1 to 5，the lower the score，the more reliable prediction圖5 豬SOCS4氨基酸序列亞細胞定位分析Fig.5 The subcellular location analyses of pig SOCS4

圖6 豬SOCS4蛋白質三維結構模型Fig.6 The 3-dimensional structure model prediction of pig SOCS4

2.7 熱應激條件下SOCS4的表達

本地土雜豬在高溫環境處理后的第1和第3天，小腸和脾組織中SOCS4 mRNA表達量顯著下調(P<0.05)。在胸腺組織中，SOCS4 mRNA的表達量在第3和第9天顯著上調(P<0.05)。而在腸系膜淋巴結中，SOCS4的表達量在高溫處理后的第1、6和9天顯著上調(P<0.05)(圖7)。

D0、D1、D3、D6和D9分別代表第0、1、3、6和9天；“**”表示差異極顯著(P<0.01)，“*”表示差異顯著(P<0.05)D0，D1，D3，D6 and D9.The 0 day，1 day，3 day，6 day and 9 day，respectively.“*” and “**” indicated the difference are significant (P<0.05) and highly significant (P<0.01)圖7 熱應激不同時段SOCS4基因在腸系膜淋巴結、脾、胸腺和小腸中的表達Fig.7 The expression of SOCS4 mRNA at different time in indicated tissues by real-time PCR

3 討 論

人類的SOCS4基因編碼440個氨基酸的前體蛋白，而小鼠SOCS4基因編碼的前體蛋白為436個氨基酸。本研究發現，本地土雜豬SOCS4基因同長白豬[21]一樣，編碼441個氨基酸的前體蛋白。同其他家族成員一樣，SOCS4基因具有家族特異性的C端40個氨基酸的SOCS box區、中央SH2區和N末端區。雖然SOCS蛋白N末端結構域具有高度無序性，但SOCS4和SOCS5的N末端卻存在一段保守序列(NTCR4-5)[16]。據報道，SOCS4的這段保守序列包含3個短小螺旋(88LKQKLQDAVG97，120HISELM125,和136DLAFRWHFIKR146)[22]，而本研究發現，SOCS4的N末端保守域內同樣存在這3段序列(圖3)。序列同源對比發現，本地土雜豬SOCS4在不同哺乳動物物種之間相似性較高，多在90%以上。可見SOCS4基因在進化過程中具有高度保守性。

SOCS家族成員之間具有高度保守的中央SH2和SOCS box結構域。其中，中央SH2區參與識別同源磷酸酪氨酸基序[14]，SOCS box則與延伸因子B、C、卡林5和環指結構域蛋白共同作用，來招募E2泛素交聯酶，形成復雜的泛素機制，不僅可以使目標蛋白降解[23]，還可保護SOCS蛋白免受蛋白酶體介導的干擾[24]。盡管SOCS4的泛素化機制尚未被證實，但它卻可以通過結合EGFRpY1092因子來參與調解STAT3信號，而且低摩爾的SOCS4還能與JAK2pY1007結合發揮作用[25]。而由于N末端長度不一，結構和功能的變化較大，使得SOCS成員之間的三維結構并不存在相似性[25]。本研究中，豬SOCS4 N端由285個氨基酸殘基組成，占自身總蛋白近2/3。其N末端結構域“NTCR4-5”除了有著蛋白整體的支架作用外[26]，這段較為保守的序列是否還存在其它特殊功能，或是否在熱應激誘發的免疫抑制中發揮作用，還有待進一步研究。

SOCS蛋白在CD4+T細胞的分化中扮演著重要的角色。研究顯示，在T細胞分化時，SOCS4在小腸、大腸和胸腺組織上出現高表達[12]。胃癌細胞SOCS4啟動子區的高甲基化可調節或參與腫瘤的生長[27]。人膽管上皮細胞SOCS4的表達受微小隱孢子蟲的誘導可調節STAT3和STAT6的磷酸化[28]等。可見，SOCS4廣泛參與了機體的生理病理變化。本研究中，高溫條件下SOCS4表達量在小腸和脾臟組織中顯著下調，而在胸腺組織上第3和9天的表達量顯著上調，腸系膜淋巴結組織上的表達量不僅在第1和第6天表現極顯著上調，且第9天也上調明顯。說明SOCS4的表達量在高溫環境下的豬各組織發生了變化，且呈組織和時間依賴性。處理時間的長短可能直接影響機體的狀態，而不同狀態下SOCS4也可能發揮不同的作用。根據報道，溫和及較短時間的應激處理能增強機體的免疫力，而高強度、長時間的應激處理，動物出現明顯的免疫抑制和炎性因子的紊亂現象[29]。此外，高溫熱應激可通過TLR4或TLR2調節炎性因子TNF-α、IL-6和IL-12等的表達[30]，而IL-12、TNF-α等細胞因子的高分泌則是CD4+T細胞向Th1的方向分化的標志[31]，進而引發自身免疫、遲發型超敏反應(DTH)等。但在熱應激豬，SOCS4與TLRs介導的信號通路以及各種炎癥因子之間的調控機制尚需進一步研究。

4 結 論

本研究成功克隆了豬SOCS4基因，并發現其在熱應激條件下的表達發生明顯的改變，且呈組織和時間依賴性。

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(編輯 郭云雁)

Cloning and Bioinformatics Analysis of PorcineSOCS4 cDNA and Its Dynamic during Heat Stress

WANG Ping1，JU Xiang-hong2,3，5*，YONG Yan-hong2，JIA Ru-min1, MA Ming-long1,ZHAO Yun-tao4，LIAO Ming3，5

(1.DepartmentofAnimalScience，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China； 2.DepartmentofVeterinaryMedicine，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China； 3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandPrevention，MinistryofAgriculture，Guangzhou510642，China； 4.ModernBiochemicalCenter，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China； 5.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

The aim of this study was to systematically elucidate the mechanism of heat stress-induced swine immunosuppression，and inflammatory factors disorder.The TZ (Luchuan pig×Landrace pig)porcineSOCS4 gene was cloned in this study，it consisted of 1 326 bp of ORF encoding a protein with 441 amino acids，285 amino acids of them formed the N-terminal of SOCS4.It shared high amino acid sequence identity with that in Landrace pigs(100.0%)，BosTaurus(96.1%)，CapraHircus(96.1%)，Feliscatus(95.2%)，Equuscaballus(94.6%)，Canislupusfamiliaris(94.3%)，Homosapiens(93.0%) andMusmusculus(88.1%).The molecular weight of SOCS4 protein was 50.5 ku，and PI was 6.60.qRT-PCR results showed that the expression ofSOCS4 in thymus gland of TZ pigs was significantly upregulated on day 3 and 9 after heat stress began (P≤0.05).As well in mesenteric lymph node，where it significantly upregulated on day 1 and 6 (P≤0.01).The expression ofSOCS4 decreased significantly in small intestine and spleen of TZ pigs during heat stress (P≤0.05).The TZ porcineSOCS4 cDNA was cloned successfully，and a significant changes ofSOCS4 mRNA expression were appeared in heat stressed pigs with a tissue and time dependence manner.

pig；SOCS4；cloning；qRT-PCR；heat stress

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.021

2014-06-12

國家自然科學基金(31101862)；中國博士后科學基金

王 萍(1988-)，女，甘肅定西人，碩士生，主要從事動物應激性致病機理研究，E-mail: 870727290@qq.com

*通信作者：巨向紅，博士，副教授，E-mail: juxh77@163.com

S858.31

A

0366-6964(2015)02-0323-09