維生素E對小鼠體內(nèi)精子品質(zhì)及精子DNA的保護作用

趙憲林，曹少杰，趙春平，郝瑞杰，桂林生，昝林森*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100;2.渭南職業(yè)技術學院，渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗檢測研究中心，渭南714000)

維生素E對小鼠體內(nèi)精子品質(zhì)及精子DNA的保護作用

趙憲林1，曹少杰2，趙春平1，郝瑞杰1，桂林生1，昝林森1*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100;2.渭南職業(yè)技術學院，渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗檢測研究中心，渭南714000)

旨在研究維生素E對小鼠精子DNA的保護作用及對精液中抗氧化物酶活性的影響。以小鼠為動物模型，選日齡、大小相同的健康雄性小白鼠50只，隨機分成5組，在試驗組小鼠的每千克日糧中分別添加4、8、12、16 g 的維生素E，對照組添加量為0，飼喂30 d后，通過頸椎脫臼處死小鼠，解剖后通過附睪和曲精細管獲得小鼠精液。通過單細胞凝膠電泳及相關檢測試劑盒檢測分析各組間精液DNA的完整性、精子活力、密度、畸形率、精漿中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、谷胱甘肽還原酶(GR)和過氧化氫酶(CAT)的活性。結果表明：每千克日糧中維生素E的添加量為12 g 時，0級精子百分率與對照組相比差異顯著(P<0.05)；添加量為8～16 g 時，精子活力與對照組相比差異顯著(P<0.05)；GR和SOD酶的活性與對照組相比差異顯著(P<0.05)。每千克日糧中維生素E添加量為12～16 g 時，CAT酶的活性與對照組相比差異顯著(P<0.05)。綜上表明，在飼糧中添加維生素E濃度為12 g·kg-1時可以明顯提高小鼠精液中CAT、GR、GSH和SOD酶的活性及精子DNA的完整性。

小鼠；維生素E；精子；DNA完整性

在家畜育種過程中，如何提高精子品質(zhì)及精子受精率，一直是人們研究的重要問題[1]。精子在體內(nèi)產(chǎn)生、生長、成熟過程中，由于各種原因使得部分或者全部精子喪失了活力，或者精漿中抗氧化酶活性不足則是導致人類男性不育的重要原因[2]。由于各種體外或體內(nèi)的原因?qū)е戮覦NA受損[3]，授精后將會導致胎兒畸形或者懷孕過程中形成死胎，引起流產(chǎn)，或者直接無法受孕[4]。所以以試驗動物為試驗模型探討如何在體內(nèi)對精子形成有效的保護，一直以來是人們研究的重點。

存在于精漿中的ROS，主要來源于芳香族氨基酸催化死亡精子所發(fā)生的反應[5]。當體內(nèi)ROS含量過多時，會對細胞、組織、器官造成一定的損傷[6]。在精液中，少量的ROS對精子的活率，頂體完整率及精子受精過程起著十分重要的作用[6-7]。當ROS在體內(nèi)產(chǎn)生過多且體內(nèi)抗氧化酶不能消除這些自由基時，ROS含量增高就會產(chǎn)生氧化應激[5]，對精子品質(zhì)造成較大的損傷，導致精漿中抗氧化酶的活性降低，影響精液品質(zhì)[6]。R.Jones 等[8]對人的精液進行研究時認為，ROS不但能降低精子的活性，而且能引起男性不育[9]。在精液中本身就含有多種抗氧化酶，其主要功能就是消除ROS，但是這些自然的抗氧化酶活性相對較弱，而精子對氧化應激較為敏感[10]。

精液中ROS 的含量與精子活率、頂體完整率、精子受精率的高低有很大的關系[11]。正常生理條件下，ROS水平和抗氧化酶活性在雄性動物生殖器官內(nèi)保持平衡狀態(tài)[12]，就不會對精子品質(zhì)造成損傷。精子最重要的使命是攜帶DNA并與卵子結合，使后代獲得父親的遺傳信息，正常的生殖功能完成離不開精子DAN的完整性。在對精液中精子DNA的研究發(fā)現(xiàn)ROS對精子DNA造成損傷[13]是造成精子DNA損傷的重要因素之一。研究表明ROS可以攻擊精子核中的DNA，這些結構的過氧化能引起堿基修飾、DNA鏈斷裂，對DNA完整性造成損傷[13-14]。DNA序列的復雜性使得精子DNA抵抗氧化侵蝕的能力非常微弱[15]，同時又缺乏DNA損傷修復機制，所以目前尋找有效的能夠較好保護精子DNA完整性的抗氧化劑迫在眉睫。

維生素E作為一種抗氧化劑對細胞的線粒體、網(wǎng)狀組織或漿膜的磷脂有著特殊的親和性[16]，存在于這些膜的特定部位，能通過抑制自由基的形成，阻止誘發(fā)的膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化[17]，從而維持精子頂體膜的完整，提高精子頂體完整率和降低精子畸形率，并且在器官組織中具有抗氧化，保護機體細胞免受自由基的毒害[18]。在精液生產(chǎn)中，通常通過添加抗氧化劑來減少和消除ROS對精子的不良作用[19]。M.I.Yousef等[20]研究發(fā)現(xiàn)給兔飼喂維生素E能夠提高兔精子的濃度和射精量，降低精子死亡率和畸形率。P.J.I.Ellis等[21]試驗發(fā)現(xiàn)，在公羊日糧中添加適量的維生素E能夠提高公羊射精量、精子活力、精液濃度，同時提高母羊的受胎率和產(chǎn)羔率。在妊娠母豬日糧中補加維生素E還可提高產(chǎn)仔數(shù)，降低仔豬斷奶前死亡率[22]。給懷孕母豬飼料中補充 20 g·kg-1維生素E，可以預防維生素E缺乏所導致的死胎、窩產(chǎn)仔數(shù)減少、仔豬早期死亡率增加及產(chǎn)后可能無乳等[23]。由此可見，維生素E對家畜的繁殖性能有重大影響。迄今為止，飼喂維生素E能否對小鼠精液中抗氧化酶的活性起到保護作用研究還未見相關報道。 本研究分別利用精子分析的常規(guī)技術和單細胞凝膠電泳技術從精子常規(guī)品質(zhì)和精子DNA方面對小鼠精子進行研究，以期對探討維生素E在動物體內(nèi)對精子保護作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器設備：恒溫水槽(上海福瑪)，水平電泳槽(北京六一)，電子天平(Mettler Toledo)，熒光顯微鏡(OLYPUS)，電冰箱(海爾BCD-205TA)，離心機(Eppendorf)，磁力攪拌器(國華)，微波爐(美的)，pH酸度計(Mettler Toledo)等。正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、NaCl、十二烷基肌氨酸鈉、TritonX-100、RNaseA、蛋白酶K、醋酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、EB、PBS、DMSO(上海生工)，維生素E、Na2EDTA和Tris(Sigma)。

1.2 溶液的配制

正常溶點的瓊脂糖溶液的配制：稱取0.2 g正常溶點的瓊脂糖，混勻在20 mL超純水，微波爐加熱45 s。低溶點的瓊脂糖溶液的配制：準確稱取0.15 g低溶點的瓊脂糖，加20 mL超純水，混勻后放置在60 ℃水浴鍋中待完全溶解后轉移到37.5 ℃。精子膜裂解液的配制：準確稱取146.25 g NaCl，37.224 g Na2EDTA，1.211 4 g Tris，10 g十二烷基肌氨酸鈉，用超純水定容到1 000 mL，溶解后調(diào)pH為10，使用前分別加2 mL TritonX-100和2 mL DMSO。平衡液的配制：稱取8.16 g，醋酸鈉和2.42 g Tris，加入200 mL超純水，溶解并調(diào)pH為10。電泳液的配制：稱取8.02 g NaOH和0.644 g Na2EDTA，用超純水定容到1 600 mL，溶解并調(diào)pH為10。

1.3 精液采集與處理

同批出生的健康雄性小白鼠50只，隨機分成5組，每組10只，單籠單鼠飼喂：在每千克小鼠日糧中維生素E的添加量分別為0、4、8、12、16 g。不同小組分別飼喂1個月后，用頸椎脫臼法將小鼠處死，用酒精棉球全身消毒后，在無菌操作臺上切開下腹部，分別取出小鼠睪丸和儲精管，并分別放入裝有1 mL PBS的小平皿中。然后將其剪成幾段并轉移至離心管中，1 400 r·min-1離心5 min，取上清液。測定精漿酶前精液的處理：小鼠被處死后，取出雙側附睪和儲精管，并立即放入提前在37.5 ℃進行預熱的含有10%胎牛血清的200 μL孵育液中，培養(yǎng)5 min,收集上清液50 μL送醫(yī)院對精子進行檢測，另外50 μL檢測精液中精漿酶活力。余下的放置37 ℃且含有5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中待用。

1.4 精子特性檢測

1.4.1 精子活力的測定及精子密度的測定 本次試驗樣品提取后直接送楊凌示范區(qū)惠仁醫(yī)院進行檢測，主要檢測精子活力和精子密度。

1.4.2 精子畸形率的測定 將精子懸液500 μL 加入2%伊紅溶液50 μL染色1 min，涂片，甲醇固定。在油鏡下每只小鼠的樣品觀察100個精子，找出頭部膨大、斷尾等與正常精子形態(tài)不同的精子，用百分率表示精子畸形率。

1.4.3 精漿酶的測定 本試驗共測定4種精漿酶的活力，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)，采用南京建成生物技術公司生產(chǎn)的試劑盒進行檢測。嚴格按照操作規(guī)程進行試驗。

1.4.4 精子DNA損傷檢測 利用單細胞凝膠電泳技術檢測DNA損傷程度。根據(jù)張忠誠等[14]介紹的方法，在熒光顯微鏡下選擇無重疊、熒光信號強的精子核計數(shù)。按照細胞熒光圖像是否像彗星一樣頭尾分明，將其分為彗星樣細胞和非彗星樣細胞，然后根據(jù)尾長將DNA損傷程度分為5級，0級：正常的非彗星樣細胞，尾長小于5%，無損傷，精子核完整；I級：尾長5%～20%，輕度損傷，可見彗尾，并且精子核縮?。虎蚣墸何查L20%～40%，中度損傷，可見明顯彗尾，精子核縮?。虎蠹墸何查L40%～95%，重度損傷，彗尾熒光信號強而密，并見明顯縮小的精子核；Ⅳ級：尾長大于95%，完全損傷，僅見熒光強而密的彗尾，精子核模糊或消失

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標準差(Mean ± SD)”表示，采用SPSS 13.0軟件和Cometscore彗星試驗圖像處理軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 維生素E的添加量對精子品質(zhì)的影響

日糧中添加不同含量的維生素E對小鼠精子品質(zhì)的影響結果見表1。當每千克日糧中的維生素E添加量為8 g時，精子活力與對照組相比差異顯著(P<0.05)。不同添加量的維生素E對小鼠精子的密度和畸形率，與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。由表中的數(shù)據(jù)可知，當每千克日糧中維生素E添加量為12 g時，小鼠精子的活力最強、畸形率最低、精子密度較大，則說明對小鼠精子的保護作用最佳。

2.2 維生素E的不同添加量對精漿酶活性的影響

不同添加量的維生素E對精漿酶活性的影響見表2。隨著維生素E添加量的增加，精漿酶活性基本呈上升趨勢。經(jīng)分析，當每千克日糧中維生素E的添加量為8 g時，過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶的活性與對照組相比差異顯著(P<0.05)；當日糧中維生素E的添加量為4 g時，超氧化物歧化酶的活性與對照組相比差異顯著(P<0.05)；但是谷胱甘肽過氧化物酶的活性與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。綜合分析可知，當日糧中維生素E的添加量為12 g時，過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性值均最大，對小鼠精子的保護作用最佳。結果說明，在動物日糧中添加維生素E可以大大提高動物的精液品質(zhì)。

表1 不同添加量的維生素E對精子品質(zhì)的影響

Table 1 The effects of different amount of vitamin E on sperm quality

維生素E添加量/(g·kg-1)AdditionofvitaminE小鼠精子活力/%Spermmotility精子密度/(×106個·mL-1)Spermdensity精子畸形率/%Malformationrate062.00±1.00d56.00±2.45a4.00±1.00a465.00±1.00bd57.00±0.82a3.33±1.53a867.00±2.00bc57.33±2.05a3.00±1.00a1270.33±2.52a61.00±2.16a2.33±0.58a1666.67±2.89bc59.33±4.78a3.00±1.00a

表中數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).下表同

Different little letters mean significant difference (P<0.05)，different capital letters mean super significant difference each other (P<0.01).The same as below

表2 不同添加量的維生素E對精漿酶活性的影響

Table 2 The effect of vitamin E on the activities of frozen-thawed semen

維生素E添加量/(g·kg-1)AdditionofvitaminE過氧化氫酶/(U·mL-1)CAT谷胱甘肽還原酶/(U·L-1)GR超氧化物歧化酶/(U·mL-1)SOD谷胱甘肽過氧化物酶/(U·L-1)GSH01.00±0.17d4.73±0.09c1.25±0.03d93.13±2.08b42.19±0.18d5.04±0.15c1.57±0.04c92.64±2.86b82.57±0.03bc5.22±0.11b1.88±0.10b99.31±2.41ab122.74±0.12a5.55±0.08a2.05±0.12a103.09±3.06a162.50±0.07bc5.28±0.14b1.87±0.04b96.89±2.42ab

2.3 最佳保護組中精子DNA的完整性分析

用Cometscore彗星試驗圖像處理軟件進行統(tǒng)計分析后，最佳保護組中精子DNA的完整性分析結果見表3。 在本試驗中0級、I級、Ⅱ級精子做了相關統(tǒng)計分析。由表3可以看出，每千克日糧中維生素E添加量為12 g，0級精子百分率和II級精子百分率與對照組相比差異顯著(P<0.05)，當添加量為8 g Ⅰ級精子百分率為23.28，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 日糧中維生素E不同添加量對小鼠精液品質(zhì)的影響

精子的活力與受精能力密切相關，既是評定精液品質(zhì)的重要指標又是評定精子是否具備輸精條件的重要因素。在對人類精液的研究上，精子品質(zhì)的高低在一定程度上決定了精子是否能夠有效地穿過女性生殖道到達受精部位，當精子品質(zhì)下降時可干擾精子受精過程，使生育指數(shù)下降[4，24]。P.Sarlos等[25]研究發(fā)現(xiàn)，維生素E是機體中最重要的抗氧化劑，能通過抑制自由基的形成，阻止誘發(fā)的膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化，提高精子頂體完整率和降低精子畸形率，同時對精子DNA完整性造成一定影響。

M.I.Yousef 等[20]證明，在日糧中補飼維生素E能有效減少兔精液中活性氧(ROS)的產(chǎn)物，有效改善精液品質(zhì)。本試驗也證明維生素E可以提高小鼠精子精液品質(zhì)，在每千克的日糧中添加 12 g的效果尤為顯著，精子活力及運動特性明顯提高，但是添加量與M.I.Yousef 等研究的不同，其原因可能是因為兔精子和小鼠精子在生物學特性上的差異，也有可能是因所添加的維生素E的形式不同，本試驗添加的為粉末狀維生素E，而非油狀的維生素E膠丸。本次試驗還表明，在日糧中添加維生素E量較少對小鼠精液品質(zhì)沒有明顯的保護作用，而添加量加大又會降低精子品質(zhì)。當每千克日糧中維生素E的添加量為12 g時，精子的活力最強，精子的密度最大，精子的畸形率最小。試驗表明，隨著維生素E添加量的增加，精子的活力增強，精子密度增大，精子畸形率減小。這可能是由于添加維生素E后，增強了精子的抗氧化能力，降低頂體脫落程度，增強頂體的完整性。

表3 不同飼喂量對精子DNA的保護作用

Table 3 Protective effect of different amount of vitamin E on sperm DNA

%

3.2 日糧中維生素E的不同添加量對小鼠精漿酶活性的影響

精子在產(chǎn)生、生長、成熟的過程中，會有部分精子死亡。 死亡精子在精漿中經(jīng)過芳香族氨基酸催化反應產(chǎn)生ROS，在精漿中，少量的ROS對于精子的獲能和頂體反應是必須的。但是精漿中的ROS過多，就會使精漿中抗氧化物酶相對減少，造成精液解凍后精子活力降低，授精率下降[26]。雖然精子擁有防御活性氧簇(ROS)的主要酶系，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。但是由于濃度和分布的局限性而使它們的清除效率降低。而維生素E作為一種抗氧化劑可以捕獲并中和一部分活性氧簇離子自由基，從而祛除自由基對精子細胞的損害[27]。H.Massaeli等[28]發(fā)現(xiàn)維生素E可以有效抑制脂質(zhì)過氧化反應；M.Sonmez等[29]研究揭示，維生素E可以減少兔睪丸中ROS的產(chǎn)生，提高精子活力。

在本試驗中，日糧中添加維生素E后，對照組和添加維生素E最適宜組(12 g·kg-1)的CAT分別為1.00和2.74 U·mL-1，SOD分別為1.57和2.05 U·mL-1，GSH分別為93.13和103.09 U·L-1，GR值分別為4.73和5.55 U·L-1。這些結果表明，在小鼠日糧中添加維生素E可以有助于提高精漿中抗氧化酶類的活力，這一結果和H.Massaeli等[28}[29]研究結果相一致。在日量中添加維生素E可以提高精漿中抗氧化酶的活性，這可能是由于維生素E作為抗氧化劑，一方面是抑制了部分自由基的產(chǎn)生，其次是維生素E可能抵御了ROS對精漿中抗氧化酶的損害，抑制了ROS的有害作用。即說明了在日糧中添加適量的維生素E能夠在體內(nèi)有效改善精子的品質(zhì)及精漿中抗氧化酶的活性。

3.3 日糧中添加維生素E對精子DNA保護情況

研究表明，ROS具有強烈的氧化特性，精子發(fā)生過程中，如果染色質(zhì)濃縮過程異常，使染色質(zhì)致密性降低，容易引起活性氧(ROS)氧化精子DNA 堿基或脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與DNA 的共價結合[12]，造成精子DNA 損傷，導致DNA鏈的斷裂，引起核DNA降解。最具破壞性的細胞內(nèi)ROS之一是羥自由基，它能夠引起DNA堿基的化學變化。作為抗氧化劑的維生素E不僅能夠體內(nèi)羥自由基的產(chǎn)生和羥自由基堿基修飾，而且還可以減少 H2O2誘導人皮膚細胞系VH10的DNA鏈斷裂，同時維生素E可以阻止吸煙引起的DNA單鏈斷裂[30]。

本研究結果表明，維生素E作為一種抗氧化劑在保護精子DNA完整性上有一定的效果。O.Tunc等對不育癥患者給予含維生素E的片劑治療后，精子核DNA 的完整性提高，凋亡精子和精液中抗氧化酶活性顯著提高[31],與本研究結果相一致。本研究結果表明，隨著小鼠日糧中維生素E添加量的增加，小鼠精子DNA“彗星”的0級精子百分率增加。并且添加量為12 g時，0級精子百分率最大，說明當日糧中維生素E的添加量為12 g時，對小鼠精子DNA的保護效果最佳，在這一結論上與O.Tunc等研究認為維生素E能提高DNA的完整性結果相同，說明維生素E對小鼠精子中的DNA具有保護作用。

4 結 論

綜上表明，日糧中隨著維生素E添加量的增加，精子活力增強，精子密度增大，精子畸形率減小，精漿酶活性增強，但是隨著維生素E的添加量加大，各項指標均有下降趨勢。當每千克日糧中維生素E的添加量為12 g時，精子活力最強，精子密度最大，精子畸形率最小，精漿酶活性最強。則說明在日糧中添加維生素E對體內(nèi)精子品質(zhì)及DNA完整性具有良好的保護作用。

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(編輯 程金華)

The Protection of Vitamin E on Quality and Integrity of Mice Semeninvivo

ZHAO Xian-lin1，CAO Shao-jie2,ZHAO Chun-ping1，HAO Rui-jie1,GUI Lin-sheng1，ZAN Lin-sen1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China; 2.WeinanVocational&TechnicalCollege，WeinanTesting&InspectionandResearchCenterofAgriculturalProductsandFood，Weinan714000，China)

This study aimed to investigate the effects of vitamin E added in diet on sperm DNA integrity and antioxidant activities of semen in mice.50 mice divided into 5 groups were fed in the experiment，in which vitamin E was added in diet with the different content of 0(Control)，4，8，12 and 16 g·kg-1，respectively.The mice were killed by cervical vertebra dislocation and dissected after 30 days when semen was obtained from epididymis and seminiferous tubules.The sperm motility，density，deformity rate and DNA integrity were detected by single cell gel electrophoresis(SCGE) assay and test kits，as well as the antioxidant activities including superoxide dismutase (SOD)，glutathione peroxidase (GSH)，glutathione reductase (GR) and catalase (CAT).The percentage of “grade 0” sperm in diet supplemented with 12 g·kg-1vitamin E was significantly higher than that of other treatment groups (P<0.05).The sperm motility was significantly improved (P<0.05) and the levels of GR and SOD in seminal plasma were significantly higher (P<0.05) by the supplementing with 8-16 g·kg-1vitamin E in diet than the control，respectively.The CAT activity in seminal plasma reached the highest level with supplementation of 12-16 g·kg-1vitamin E in diet，when compared to the others (P<0.05).In conclusion，we could infer that 12 g·kg-1vitamin E added could obviously improve the sperm DNA integrity and the antioxidant activities of CAT，GR，GSH and SOD in seminal plasma.

mice；vitamin E；sperm；DNA integrity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.022

2014-11-02

“十二五”國家863計劃(2011AA100307-02)；國家自然科學基金(31272411)；新疆建設兵團重大科技計劃(2014AA001-1)；“十二五”國家轉基因育種重大專項(2014ZX08007-002)

趙憲林(1984-)，男，河南濮陽人，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖的相關研究，E-mail:xianlin688@126.com

*通信作者：昝林森，教授，博導，E-mail:zanlinsen@163.com

Q492.6

A

0366-6964(2015)02-0332-07