鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附和侵襲特性

張秀平，陳 陸，趙 軍，王川慶，李永濤，劉紅英，彭志鋒，盧彩景，敬文憲，楊 霞

(河南農業大學，禽病研究所，鄭州 450002)

鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附和侵襲特性

張秀平，陳 陸，趙 軍，王川慶，李永濤，劉紅英，彭志鋒，盧彩景，敬文憲，楊 霞*

(河南農業大學，禽病研究所，鄭州 450002)

為研究鴨源雞桿菌(G.anatis)體外黏附和侵襲細胞的能力，選擇HeLa 細胞為感染模型，分別以細菌黏附和侵襲HeLa 細胞數量為指標，借助革蘭和姬姆薩染色及電鏡觀察來研究2株不同來源的鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附和侵襲特性。結果顯示：黏附計數表明鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附HeLa 細胞，菌株感染30、60、90、120、150 min后每細胞黏附的細菌數分別為0.84、4.68、8.52、9.27、8.2個，而菌株F149T對HeLa細胞有較低的黏附作用。侵襲試驗表明Yu-PDS-RZ-1-SLG有低度侵襲力，侵襲的細菌數在150 min時達到最大，約8.27·1 000細胞-1，隨后細胞破碎，細胞逐漸脫落，而菌株F149T未檢測到侵襲力。染色及電鏡試驗進一步證實鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG可黏附于HeLa細胞表面并侵入細胞內部。菌株經胰蛋白酶處理后，細菌的黏附率顯著降低，表明細菌的表面蛋白參與黏附。黏附和入侵特性是鴨源雞桿菌定殖在組織表面重要的能力，該細胞模型的建立為進一步研究其致病機制提供了條件。

鴨源雞桿菌；細胞黏附；細胞侵襲；HeLa 細胞

雞桿菌屬(Gallibacterium)是革蘭陰性巴氏桿菌科中一個新屬，代表種為鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis)[1-2]。鴨源雞桿菌是構成雞上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分，最近證明也與產蛋雞輸卵管炎、輸卵管囊腫及腹膜炎等有關，能引起雞產蛋量下降和死亡[3-4]。2008年，王川慶等[5]首次報道了中國雞場中鴨源雞桿菌的感染情況，從病雞的卵巢、輸卵管、肝等器官均分離出了鴨源雞桿菌。對中國部分地區雞群進行雞桿菌血清流行病學調查發現，抗體陽性率達45.06%[6]，說明雞桿菌感染已成為中國雞群發生腹膜炎和輸卵管炎疾病的重要病因。2013年首次報道鴨源雞桿菌能夠感染人[7]，更引起了全世界的高度重視。但目前對其致病機制的研究還相對缺乏。

病原菌定殖和入侵宿主的第一步是黏附，不同的病原菌可以表達不同的黏附因子。一部分病原菌黏附于宿主黏膜上皮細胞表面并在局部繁殖，在整個感染過程中一直停留在那里，進一步分泌毒素或其他毒力因子，作用于被感染的宿主細胞使其發生病變，如霍亂弧菌；而另外一些病原菌在黏附于宿主細胞表面后還要進一步內在化，即侵入宿主細胞內部，這種特性被稱作侵襲(invasion)[8]。細菌黏附和侵襲模型包括動物模型、細胞模型等。細胞模型是近年來應用較多的一類細菌黏附和侵襲模型，具有重復性好和周期短的優點，如HeLa細胞(人宮頸癌細胞系)、Int407(人胚胎腸黏膜細胞系)、Vero細胞(非洲綠猴腎異倍體細胞)、CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)及原代細胞模型等；其中 HeLa細胞是生物學與醫學研究中被廣泛應用的一種傳代細胞，已經成為醫學研究中非常重要的工具，且在巴氏桿菌科中作為黏附與侵襲模型早有應用[9]。

目前，已經證實鴨源雞桿菌能黏附到塑性表面及雞口咽原代上皮細胞上[10-11]，在感染黏膜組織，定殖上呼吸道過程中有重要作用。但鴨源雞桿菌能否體外黏附和侵襲傳代細胞尚未見報道。因此，本試驗嘗試選擇HeLa細胞為感染模型，分別以慶大霉素保護試驗、革蘭染色和姬姆薩染色及電鏡觀察來研究鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附和侵襲能力，以期為進一步研究該病原菌的致病機制，控制病原菌的繁殖，降低其侵襲力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鴨源雞桿菌參考菌株F149T(ATCC43329T)分離自丹麥的健康鴨，由德國勃林格公司惠贈；鴨源雞桿菌菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG是從平頂山汝州發病雞的輸卵管上分離的菌株，經本實驗室鑒定保存。1.1.2 主要試劑 DMEM/F12 細胞培養基購于GIBCO 公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS) 購于武漢三利公司；慶大霉素購自山東華信制藥有限公司；細胞培養板購自NEST Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養 取試驗菌株接種于綿羊血瓊脂平板，37 ℃培養18～20 h，挑單菌落接種于含5%胎牛血清的LB肉湯中，37 ℃ 200 r·min-1培養18～20 h，按1∶100的比例轉接于上述新鮮培養基中，37 ℃培養至細菌達到對數期，采用平板活菌計數法測定細菌濃度。試驗前，培養物用不含雙抗的DMEM/F12培養基洗滌3次，并稀釋到所需濃度。1.2.2 細胞培養 HeLa細胞為本實驗室保存。將培養瓶中長滿單層的細胞，用細胞消化液(2.5 g·L-1胰酶，0.2 g·L-1EDTA)消化后，用不含抗生素的DMEM/F12培養基懸浮，以105個細胞·孔-1接種于24 孔板，置37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養，待長滿單層后用于試驗。為了確保HeLa細胞在接種鴨源雞桿菌后，細胞的活力不受影響，試驗采用cell counting kit-8 cck-8 試劑盒以及臺盼藍染色檢測細胞的活性。

1.2.3 黏附試驗 試驗參照文獻[12]提供的方法并稍加改動。長成單層的細胞，用PBS洗3遍，每孔加入500 μL用DMEM/F12重懸稀釋的菌液(細菌與細胞感染比分別為10、50、100)，37 ℃、5% CO2分別培養30、60、90、120、150 min，傾去孔中液體，用PBS洗5次。每孔加入500 μL的胰酶-EDTA消化5 min，收集部分細胞，1 200 × g離心5 min，棄上清，用不含抗生素的DMEM/F12培養基懸浮，通過臺盼藍染色確定細胞活力。剩余的細胞每孔加入500 μL 1% 的Trition X-100溶解混勻，取100 μL連續10倍倍比稀釋菌液，均勻涂布于綿羊血瓊脂平板，計算每孔溶解液中細菌數量。黏附率表示為在接種鴨源雞桿菌后，每個HeLa 細胞表面的平均細菌，即每孔溶解的細菌數/每孔接種的細胞數。試驗時每個處理設4 個重復，整個試驗重復3次。1.2.4 侵襲試驗 采用慶大霉素保護試驗[12-13]，參照黏附試驗接種細菌至細胞上，24孔板在37 ℃含有5% CO2的環境中培養后，傾去孔中液體，用PBS洗3次，接著每孔加入1 mL含慶大霉素(100 μg·mL-1)的DMEM/F12，繼續孵育1 h，以殺死細胞外細菌，再用PBS洗5次。為了確保在抗生素使用后能100% 的殺死胞外菌，取100 μL 最后一次的PBS 洗滌液涂布綿羊血瓊脂平板。細胞活力測定及細胞溶解的處理方法同黏附試驗，最后直接取100 μL 涂布綿羊血平板，計算裂解液中細菌數量。侵襲率表示為在使用慶大霉素后，每個HeLa 細胞里的平均細菌數，即每孔裂解的細菌數/每孔接種的細胞數。試驗時每個處理設4 個重復，整個試驗重復3次。1.2.5 用胰蛋白酶處理菌體對細菌黏附力的影響 取達到對數期的細菌于離心管中，4 000 × g離心5 min，棄上清液后用2.5 g·L-1胰蛋白酶處理鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T菌體，37 ℃下孵育10 min。處理后菌體經PBS充分洗滌，懸浮并稀釋成所需濃度。處理后再進行菌落計數，然后按“1.2.3”中的方法進行黏附試驗。

1.2.6 革蘭染色和姬姆薩染色觀察細菌黏附和侵襲 細胞接種于預先放有8 mm × 8 mm蓋玻片的細胞培養板中，當細胞在蓋玻片上形成單層后，接種濃度為107cfu·mL-1的鴨源雞桿菌懸液1 mL，置37 ℃培養箱中孵育。吸去菌液，用無菌的PBS 洗滌3 次，用甲醇∶冰乙酸=3∶1 固定液固定5 min，自然干燥。經革蘭染色和姬姆薩染色后水洗，干燥、封片，置于油鏡下觀察黏附和侵襲情況。同時以DMEM/F12培養基作為對照組。1.2.7 掃描電鏡觀察細菌黏附細胞 方法同黏附試驗，當細菌在含有玻片的培養基上孵育90 min時，用常規方法固定制片后用S-3400 掃描電鏡觀察。1.2.8 透射電鏡觀察細菌侵襲細胞 透射電鏡用細胞不加蓋玻片，細胞在一次性T25細胞培養瓶中培養至單層，接種細菌懸液共同孵育90 min后，PBS洗3次，用2.5% 的戊二醛溶液固定2 h 后，換新鮮固定液固定過夜，用無菌細胞刮刀刮下細胞，4 000 r·min-1離心10 min，棄去固定液。常規方法固定，超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙重重金屬染色后，置于JEM-1400 透射電鏡下觀察。

1.2.9 統計分析 所有數據采用Graphpad Prism 5作圖表示，應用SPSS11.5 軟件進行統計分析。對試驗結果采用方差分析T檢驗進行統計學處理，以P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 鴨源雞桿菌對HeLa 細胞活力的影響

為確保接種鴨源雞桿菌后HeLa 細胞的活力不受影響，在接種鴨源雞桿菌菌株150 min時采用cell counting kit-8 cck-8 試劑盒以及臺盼藍染色檢測細胞的活性。與不加細菌的對照相比，鴨源雞桿菌菌株F149T及Yu-PDS-RZ-1-SLG 在黏附和侵襲試驗期間對HeLa細胞均無毒性影響。所有對照組及試驗組細胞在接種細菌后150 min時至少有85%～90% 的活力。

150 min后，菌株F149T接種的細胞基本維持正常，而菌株 Yu-PDS-RZ-1-SLG 接種的細胞，細胞破碎、逐漸脫落，因此試驗選擇150 min之前研究細菌的侵襲和黏附。

2.2 感染復數(MOI)的確定

運用鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株做黏附預試驗中，分別以MOI為10、50、100 感染HeLa細胞確定合適的感染復數。從圖1可以看出隨著時間的推移，黏附數量逐漸增加；30 min時，3個不同濃度組之間均差異不顯著(P>0.05)；60、90和120 min時，MOI為50和100的菌量組之間差異不顯著(P>0.05)，但二者與MOI為10的濃度組相比均差異顯著(P<0.05)，且120 min時，MOI為100黏附數量達到最高，因此在后續的研究中以MOI為100為感染復數進行細菌的黏附和侵襲試驗研究。

2.3 鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附結果

2株鴨源雞桿菌均能黏附HeLa細胞。如圖2所示，在MOI為100時2株鴨源雞桿菌黏附HeLa細胞均具有時間依賴性。隨著時間的延長，每個細胞上的黏附細菌數量逐漸增加，至120 min時達到最大的細菌黏附數量，且鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa 細胞的黏附數量在60至150 min均顯著高于鴨源雞桿菌F149T株。120 min黏附數量最大時鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株每個細胞黏附數為9.27，F149T株僅為0.99，前者的黏附數量將近是后者的10倍，并且鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株黏附數在90、120、150 min時與30 min時相比，差異顯著(P<0.05)。

*表示在60、90和120 min時，MOI為50和100的濃度組與MOI為10的濃度組相比均差異顯著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared to the incubation at MOI of 10圖1 不同MOI濃度鴨源雞桿菌(10、50、100)在不同時間點黏附HeLa 上皮細胞趨勢Fig.1 The general adhesion trend of G.anatis strain to HeLa cells from 30 to 150 min at different MOI(10，50，100)

2.4 鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附染色試驗

革蘭染色結果表明：鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG對HeLa細胞具有黏附力。光學顯微鏡油鏡(×1 000)下可見到HeLa細胞周圍有菌體黏附于細胞表面。感染后30 min時，黏附的細菌數量較少，多數細菌游離在細胞之外。隨著時間的延長，黏附在細胞周圍的數量逐漸增加，感染后120 min時，單個細胞周圍有較多的細菌(圖3a～d)，染色結果與黏附數量基本一致。

*表示和30 min 相比差異顯著(P<0.05)；**表示和菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG 相比差異顯著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared to 30 min of incubation；**Significant differences(P<0.05) compared to Yu-PDS-RZ-1-SLG strain圖2 鴨源雞桿菌F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG對HeLa 細胞的黏附Fig.2 Kinetics of adherence of G.anatis F149T and Yu-PDS-RZ-1-SLG strains to HeLa cells

2.5 掃描電鏡觀察鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附

掃描電鏡顯示鴨源雞桿菌菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的HeLa細胞表面有短桿菌黏附(圖4a)，進一步確定了鴨源雞桿菌對HeLa細胞的黏附。而F149T感染的HeLa細胞表面未見有明顯的黏附細菌，單個細菌游離在細胞之外(圖4b)。

2.6 用胰蛋白酶處理鴨源雞桿菌后對HeLa細胞的黏附

胰蛋白酶處理F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG菌體后，細菌的增殖未受到明顯影響，而細菌對細胞的黏附數量明顯下降，黏附均受到較大程度的抑制(P<0.01)，尤其是Yu-PDS-RZ-1-SLG株下降更顯著(圖5)，說明表面蛋白參與了細菌的黏附。

2.7 鴨源雞桿菌對HeLa細胞的侵襲

慶大霉素保護試驗顯示，鴨源雞桿菌F149T株對HeLa無侵襲力，Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細胞有侵襲力，且接種30 min后，每1 000個細胞內的細菌數量為2.73，90 min時達5.87，差異顯著；在120、150 min時差異不顯著(P>0.05)，但150 min時侵襲數量達到最大值，即每1 000個細胞內侵入細菌數約為8.27。侵襲數在120、150 min時與30、60 min相比，差異顯著(P<0.05)(圖6)。隨后，鴨源雞桿菌 Yu-PDS-RZ-1-SLG株接種的細胞出現變圓、腫脹、脫落，細胞內顆粒增多的病變現象。

2.8 鴨源雞桿菌對HeLa細胞的侵襲染色試驗

姬姆薩染色結果表明：鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細胞具有侵襲力。光學顯微鏡油鏡(1 000×)下可見到HeLa細胞周圍有染色深淺不一的菌體，黏附于細胞表面或者侵入到細胞的內部。隨著時間的延長，黏附和侵入的細菌數量逐漸增加，感染后120 min時，單個細胞表面和內部均有較多的細菌(圖3e～h)，染色結果與侵襲結果基本一致。

2.9 透射電鏡觀察鴨源雞桿菌對HeLa細胞的侵襲結果

透射電鏡顯示鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株感染的HeLa細胞上有細菌緊密結合于細胞膜或細胞表面微絨毛上，細胞內有侵襲現象(圖7a)。而F149T感染的HeLa細胞未見有侵襲的細菌，單個細菌游離在細胞間(圖7b)。

a～d.鴨源雞桿菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG感染HeLa細胞后30、60、90、120 min時革蘭染色(標尺=20 μm);e～h.鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG感染HeLa細胞后30、60、90、120 min時姬姆薩染色(標尺=20 μm)a-d.Gram staining of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain at 30，60，90，120 min after infection respectively(Bars = 20 μm);e-h.Giemsa staining of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain at 30，60，90，120 min after infection respectively(Bars=20 μm) 圖3 鴨源雞桿菌感染HeLa細胞的染色圖片Fig.3 Staining of G.anatis after infection to HeLa cells

3 討 論

細菌的致病機制錯綜復雜，其毒力取決于侵襲力和毒素兩方面，而侵襲力又由細菌的黏附和侵襲、繁殖與擴散以及對宿主防御機能的抵抗等諸因素構成。黏附是病原菌引起感染發生的第一步，因此，成功地黏附在黏膜表面，才有可能在宿主體內定殖，進而引發感染，表現一系列的病理變化并出現臨床癥狀。盡管鴨源雞桿菌能黏附上皮細胞[11]，具有凝聚紅細胞的能力[14]，但是鴨源雞桿菌能否黏附和侵襲HeLa細胞尚未見報道。HeLa細胞來源于人的子宮上皮癌細胞株，是研究病原菌感染的理想細胞系，廣泛應用于大腸桿菌、沙門菌、志賀菌和巴氏桿菌等的侵襲試驗中[9,15-16]。因此，本研究也嘗試采用HeLa細胞作為上皮細胞侵襲模型研究鴨源雞桿菌感染細胞的特性。

a、b.鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T在MOI=100時，對HeLa 細胞感染90 min時掃描電鏡結果a，b.Scanning electron micrograph of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG and F149T strains at 90 min after infection at MOI of 100 respectively圖4 鴨源雞桿菌感染HeLa細胞的掃描電鏡Fig.4 Scanning electron microscopy of G.anatis after infection to HeLa cells

*表示和處理組相比差異極顯著(P<0.01)*Significant differences (P<0.01) compared with experimental group圖5 鴨源雞桿菌F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG在胰蛋白酶處理后對HeLa細胞的黏附Fig.5 Adherence of G.anatis F149T and Yu-PDS-RZ-1-SLG strains to HeLa cells after treatment with trypsase

*表示和接種30、60 min 相比差異顯著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared with 30 and 60 min of incubation圖6 鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG對HeLa細胞的侵襲Fig.6 Kinetics of invasion of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain to HeLa cells

本試驗證實，分離的鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株能夠黏附HeLa細胞，且隨著感染時間的增加，HeLa細胞表面黏附的細菌數也逐漸增加。在120 min時，黏附數目最高，表明細胞表面的受體已經飽和，只有有限數量的細菌能夠黏附到HeLa上皮細胞。M.L.S.Lucio等[11]在研究鴨源雞桿菌對雞口咽上皮細胞的黏附中，發現F149T能黏附雞口咽上皮細胞，而且鑒定了兩個假定的菌毛蛋白可能參與黏附。本試驗中F149T對HeLa細胞的黏附能力相對較弱，推測可能是F149T菌株表面缺乏相應的參與黏附HeLa細胞的因子，部分細菌非特異性黏附在細胞的表面。

慶大霉毒保護試驗結果表明，鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細胞有侵襲力，且其隨感染時間的增加而增加；另外，在感染該菌150 min后，HeLa細胞的結構發生明顯的變化，變圓，腫大，脫落。而菌株F149T對HeLa細胞無明顯侵襲力，且其感染的HeLa細胞和對照組相比沒有可見的改變。文獻[17]顯示細菌的致病因素(黏附素)能夠使一些細胞的細胞膜發生病變，使細胞膜突起，或者形成褶皺。曾巧英等[18]在研究中發現豬鏈球菌2 型在黏附扁桃腺上皮細胞5 h后，細胞表面微絨毛脫落，細胞膜吐泡，有明顯的凋亡跡象。B.M.Kris-tensen等[19]研究發現鴨源雞桿菌對巨噬細胞有細胞毒作用，可能在發病機制上扮演著重要的角色。由于本試驗中所用鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株有很強的致病性和溶血活性，而菌株F149T無明顯的致病力(另文報道)，是否因為2株菌不同的致病性對HeLa細胞的影響不同還有待于進一步研究。

a、b.鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T在MOI=100時，對HeLa細胞感染90 min的透射電鏡(標尺=1 μm)a，b.Transmission electron micrograph of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG and F149T strains at 90 min after infection at MOI of 100 respectively (Scale bars=1 μm)圖7 鴨源雞桿菌感染HeLa細胞的透射電鏡Fig.7 Transmission electron microscopy of G.anatis after infection to HeLa cells

細菌的黏附通常需要一些結構物質的參與，諸如菌毛、鞭毛、凝集素、細菌蛋白和外膜囊泡等在最初的黏附過程中都起著關鍵的作用[11,20-21]。為了進一步闡明Yu-PDS-RZ-1-SLG菌株黏附HeLa細胞與哪種黏附分子密切相關。試驗中將菌株用胰蛋白酶處理后，發現能顯著抑制細菌的黏附，但是用胰蛋白酶處理的細菌的活力卻不受影響，表明細菌的某種表面蛋白參與黏附過程。鴨源雞桿菌表面假定的菌毛能夠促進細菌黏附在雞組織表面，而且可能是多種蛋白質參與細菌的黏附，增加了對易感宿主感染的可能性[11]。而在鴨源雞桿菌12656-12中已經證實有4個假定的菌毛蛋白[22]，所以，Yu-PDS-RZ-1-SLG菌株黏附HeLa細胞過程是一種蛋白質參與還是多種蛋白質的協同作用還需要進一步證實。因此，后續的工作主要是建立鴨源雞桿菌菌毛蛋白突變株，鑒定參與這些過程的分子，進一步了解黏附機制。

致病菌與細胞的相互作用機制是目前研究的熱點。本研究證明分離自患輸卵管炎蛋雞的鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細胞具有黏附力和侵襲力，而分離自健康蛋雞的F149T株與前者的黏附和侵襲特性有明顯差異；黏附與侵襲具有時間及劑量依賴性，僅有限的細菌能黏附到細胞的表面，并表達與細胞表面相結合的蛋白質，進而黏附和侵入細胞，這些黏附相關蛋白質可能在其致病過程中起到重要的作用，但其在菌體表面以何種形式存在，還有待進一步研究。雖然體外細胞模型不能完全反映體內的真實情況，并且HeLa細胞的表面受體與宿主雞輸卵管上皮細胞不一致，但很多試驗表明，細菌對體外細胞的黏附力和侵襲力與其致病性呈平行關系。

4 結 論

以上研究表明，鴨源雞桿菌能黏附和侵入HeLa上皮細胞，此模型的建立為該病菌后期致病機制的深入研究奠定了基礎。

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(編輯 白永平)

Adhesion and Invasion Characteristics ofGallibacteriumanatisto HeLa Cells

ZHANG Xiu-ping，CHEN Lu，ZHAO Jun，WANG Chuan-qing，LI Yong-tao， LIU Hong-ying，PENG Zhi-feng，LU Cai-jing，JING Wen-xian，YANG Xia*

(InstituteofPoultryDiseases，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

In order to determine the cell adhesion and invasion characteristics ofGallibacteriumanatis(G.anatis)，aninvitroHeLa cell model was established.The adhesion and invasion characteristics of 2 strains were evaluated by means of adhesion and invasion experiment，Gram and Giemsa staining，Scanning electron microscopy and Transmission electron microscopy.Adhesion counting assay demonstrated that the high adhesive ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain and adhering bacteria numbers were 0.84·cell-1，4.68·cell-1，8.52·cell-1，9.27·cell-1and 8.2 ·cell-1at 30，60，90，120，150 min after infection，respectively.G.anatisF149Tstrain revealed a weak adhesive level.Invasion assay showed weak invasive ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain and no invasion ofG.anatisF149Tstrain，and invading bacteria numbers ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain reached the maximum at 150 min，about 8.27 per 1 000 cells，but cell disruption，cell activity weakened subsequently.Staining results and electron microscopy experiments further confirmed thatG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain adhere to surface and invade Hela cells.Adherence was prevented by treating bacterial cells with trypsin，suggesting the participation of proteins in this process.The adhesive and invasive capacity could be an important ability for colonization of tissue surfaces ofG.anatis.The establishment of cell model provided the basis for further research on pathogenic mechanism ofG.anatis.

G.anatis;adhesion;invasion;HeLa cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.017

2014-06-09

國家自然科學基金(31302090)；河南省高校科技創新團隊支持計劃(14IRTSTHN015)

張秀平(1986-)，女，河南商丘人，碩士生，主要從事分子病原學研究，E-mail：zhangxiuping722@163.com

*通信作者：楊 霞(1973-)，女，河南扶溝人，副教授，博士，主要從事分子病原學研究，E-mail：yangxia66@163.com

S852.612

A

0366-6964(2015)02-0295-08