益眠達片質量標準研究

2015-03-22 03:46:50胡衛東高永喜李衛興曾凡波

中國藥業 2015年2期

汪濤，胡衛東，高永喜，李衛興，曾凡波

（1.中國人民解放軍武漢療養院，湖北武漢 430074； 2.華中科技大學同濟醫學院藥學院，湖北武漢 430030）

益眠達片質量標準研究

汪濤1，胡衛東1，高永喜1，李衛興1，曾凡波2

（1.中國人民解放軍武漢療養院，湖北武漢 430074； 2.華中科技大學同濟醫學院藥學院，湖北武漢 430030）

目的建立益眠達片的質量控制方法。方法用薄層色譜（TLC）法對首烏藤、合歡皮進行定性鑒別；用高效液相色譜（HPLC）法測定益眠達片中五味子所含五味子醇甲的量，色譜柱為Shiseido Capcell Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇－水（55∶45），檢測波長為250 nm。結果 TLC檢出了首烏藤、合歡皮特征斑點；五味子醇甲進樣量在0.118 9～1.189 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系（r＝0.999 9），加樣回收率為98.55%，RSD為1.47%（n＝6）。結論所建立的質量控制方法簡便、穩定、可靠，可作為該制劑的質量控制方法。

益眠達片；質量標準；高效液相色譜法；薄層色譜法

益眠達片為中國人民解放軍武漢療養院研制開發的純中藥制劑，于2011年取得軍隊醫療機構制劑臨床研究批準文號（廣L2011002），具有益氣生津、安神補腦、鎮靜安眠的作用，用于治療失眠、多夢、胸脅脹滿、郁悶不舒、心煩心悸、頭痛健忘、神經衰弱、抑郁、焦慮等癥。為更好地控制產品質量，對首烏藤和合歡皮進行了薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對方中五味子中的活性成分五味子醇甲進行了含量測定，為該制劑建立完善的質量標準提供了依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括HP－1110四元泵，HP－1110 DAD檢測器，HP Chemstation化學工作站（Agilent公司）；電子天平（CP225D，1／10萬）；KQ－500B型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。硅膠H薄層板、硅膠G薄層板均由青島海洋化工廠分廠提供。五味子醇甲對照品（供含量測定用，批號為110857－200405）、大黃素對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；益眠達片（批號分別為 130513，130407，130314，由中國人民解放軍武漢療養院提供）。甲醇為色譜純（Lanscanltd），水為純水機凈化水（純水機型號Millipore Milli－Qbiocel），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

首烏藤：取本品10片，研細，加乙醇50 mL，超聲處理30 min，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取大黃素對照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。另取缺首烏藤的模擬片20片，按供試品溶液制備法制備陰性對照品溶液。照TLC法［1］試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠H板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點（見圖1）；置氨蒸氣中熏后，斑點變為紅色。

合歡皮：取本品10片，研細，加50%甲醇30 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇5 mL使溶解，用正丁醇振搖提取2次，每次5 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取合歡皮對照藥材1 g，同法制成對照品溶液。另取缺合歡皮的模擬片20片，按供試品溶液制備法制備陰性對照品溶液。照TLC法［1］試驗，吸取上述3種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－甲酸（13∶5∶2）的下層溶液（每10 mL加甲酸0.1 mL）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇試液，在90℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點［2］，見圖2。

圖1 首烏藤薄層色譜圖

圖2 合歡皮薄層色譜圖

2.2 五味子醇甲含量測定［3－7］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido Capcell Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－水（55∶45）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：250 nm；柱溫：40℃［3］。分離度（R）大于1.5，理論板數按五味子醇甲峰計算應不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

精密稱取五味子醇甲對照品15 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 mL中含五味子醇甲60 μg）。取本品20片，研細，置分液漏斗中，用乙醚提取4次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按樣品處方制備缺五味子的模擬樣品，精密量取10 mL，按擬訂方法制備陰性對照品溶液。將上述3種溶液分別注入高效液相色譜儀進行測定，得色譜圖（見圖3）。可見，供試品溶液與對照品溶液在相應位置上有相似峰，而陰性對照品溶液則無此峰出現。

2.2.3 方法學考察

圖3 高效液相色譜圖

標準曲線制備：精密稱取五味子醇甲對照品14.86mg，置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得59.44 μg／mL五味子醇甲對照品溶液，分別吸取2，4，6，10，20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以五味子醇甲對照品溶液進樣量（X）為橫坐標、峰面積值（Y）為縱坐標繪制標準曲線［3］，得回歸方程 Y＝1.976×106X＋6.830×103，r＝0.999 9（n＝5）。結果表明，五味子醇甲進樣量在0.118 9～1.189 μg范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：精密量取同一對照品溶液10 μL和供試品（批號為130513）溶液各10 μL，按擬訂色譜條件重復進樣6次。結果五味子醇甲色譜峰平均峰面積為1134196，RSD為0.47%（n＝6），供試品色譜峰平均峰面積為1 452 514，RSD為0.31%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品（批號為130513）溶液10 μL，分別于配制后0，1，4，8，15，24 h的依法測定。結果的 RSD為1.63%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為130513）溶液6份，精密量取10 mL，分別依法制備供試品溶液，并進樣測定。計算得五味子醇甲的平均含量為0.064 g／L，RSD為1.27%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗［7］：精密量取已知含量的同一批樣品（批號為130513，含量為0.063 52 g／L）5 mL，精密加水5 mL，混勻，再精密加入五味子醇甲對照品（0.273 0 g／L）乙醚溶液20 mL，振搖提取，分取乙醚層，水層溶液繼續用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并4次乙醚提取液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液，依法進樣測定含量并計算回收率。結果見表1。

表1 五味子醇甲加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，采用外標法計算五味子醇甲的質量分數。結果批號為 130513，130407，130314的3批樣品中五味子醇甲含量分別為每片 0.063，0.055，0.057 mg，平均含量為每片0.058 mg。

3 討論

益眠達片由合歡皮、首烏藤、生地、熟地、五味子等藥組方。合歡皮甘平，入心、肝、脾經，有解郁安神之功，《神農本草》謂合歡有“安五臟，和心志，令人歡樂無憂”之說，其所含皂苷、鞣質等有鎮靜作用，用于憤怒、憂郁所致失眠、虛煩不安。首烏藤甘、苦、澀，微溫，入肝、腎經，有補肝腎、益精血、養心安神、養血通絡的作用，用于陰虛血少之須發早白、眩暈目眩、腰膝酸軟乏力者，常與熟地黃同用。現代藥理學研究表明，首烏藤和根莖含蒽醌類，主要為大黃酚、大黃素、大黃素甲醚等蒽醌類化合物，主要用于心神不寧、失眠多夢［8］。生地甘、微苦、寒，入心、肝、腎經，寒性較大，汁液較豐，長于清熱涼血生津、滋陰補腎。熟地甘、微溫，入心、肝、腎經，滋陰補血，治陰虛血少、腰膝痿弱［9］。五味子具有潤肺、止汗、滋腎、澀精的功效，能夠增強機體免疫力，抑制機體中樞神經系統［10］。諸藥合用，共奏滋陰養血、清熱解郁，寧心安神之功效。

按本品處方比例及制備工藝分別制備不含首烏藤、合歡皮的缺味樣品并制成陰性對照品溶液，分別與相應的供試品同板進行薄層色譜試驗。結果，各陰性對照均無相應斑點，該2味藥的鑒別方法具有專屬性。

本研究中，采用TLC法對益眠達片中首烏藤、合歡皮2味藥材進行鑒別，并采用HPLC法對方中五味子中的活性成分五味子醇甲進行含量測定，方法簡便，專屬性和重復性好，且結果穩定，可用于益眠達片的質量控制。

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