環丙沙星聯用磷霉素抗尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的協同作用體外研究

宋 潔，何召云，宮海燕，許思權，陳先華

（1.中國人民解放軍第三軍醫大學西南醫院預防保健科，重慶 400038；2.中國人民解放軍302醫院肝硬化診療中心，北京 100039）

環丙沙星聯用磷霉素抗尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的協同作用體外研究

宋 潔1，何召云2，宮海燕1，許思權1，陳先華1

（1.中國人民解放軍第三軍醫大學西南醫院預防保健科，重慶 400038；2.中國人民解放軍302醫院肝硬化診療中心，北京 100039）

目的 觀察環丙沙星和磷霉素聯合應用抗尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的體外協同作用。方法 采用常規方法進行細菌分離和菌種鑒定。最低抑菌濃度（MIC）測定采用微量肉湯稀釋法，聯合抑菌濃度指數（FICI）測定采用棋盤法。結果 82株耐環丙沙星銅綠假單胞菌中，環丙沙星和磷霉素聯合應用對22株細菌有協同抗菌作用，占26.83%。急性殺菌作用中，選取環丙沙星和磷霉素聯合應用后協同抗菌作用和環丙沙星 MIC降低均最明顯的銅綠假單胞菌P34和P58作為研究對象，結果在藥物處理8 h時，環丙沙星和磷霉素聯合處理組的細菌數明顯低于兩種藥物單獨處理組。濁度試驗結果顯示，藥物處理3 h后，聯合用藥組與單獨用藥組細菌濁度出現明顯差異。結論 環丙沙星和磷霉素聯合應用不但具有抗耐環丙沙星銅綠假單胞菌的協同作用，且具有較強的殺菌效果和溶菌作用。

尿路感染；環丙沙星；磷霉素；銅綠假單胞菌；協同作用

尿路感染約占院內感染的40%，由于發病率高，不但會增加患者死亡率，還會增加患者的精神負擔和經濟負擔，已引起臨床高度關注［1］。大腸埃希菌仍是醫院或社區獲得性簡單尿路感染中最常見的細菌病原體，然而在復雜的尿路感染中，僅20%左右的感染由大腸埃希菌引起，銅綠假單胞菌是最重要的病原菌［2］。尤其在長期留置導尿管的患者中，約35%的導尿管相關尿路感染由銅綠假單胞菌引起［3］。大多數銅綠假單胞菌具有較高的耐藥性，且可在抗菌藥物治療過程中獲得新的耐藥性或形成細菌生物膜，使得尿路感染反復發作、遷延難愈。目前，臨床口服喹諾酮類藥物的廣泛應用，導致銅綠假單胞菌耐藥性的出現［4－5］。磷霉素是一種天然的抗菌劑，具有廣譜的抗菌活性［6－7］。磷霉素因其良好的穩定性、理想的藥代動力學參數、良好的耐受性和臨床療效，已成功地用于治療簡單的尿路感染［8］。環丙沙星與磷霉素聯合應用，對囊性纖維化患者感染的銅綠假單胞菌有協同抗菌作用［9］。然而，這兩種抗菌藥物聯合應用對尿路感染的銅綠假單胞菌的協同作用鮮有報道。為此協同作用，筆者以耐環丙沙星的銅綠假單胞菌為研究對象，檢測其聯合抑菌濃度指數（FICI）和急性殺菌作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源、藥物、試劑與設備

82株耐環丙沙星銅綠假單胞菌臨床菌株分離于西南醫院尿路感染患者的臨床送檢標本，剔除同一患者的重復菌株。根據《美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS，2010）標準》，環丙沙星對銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（MIC）≥4 μg／mL定義為耐藥。質控菌株銅綠假單胞菌（ATCC27853，中國藥品生物制品檢定所）。環丙沙星（CIP，中國食品藥品檢定研究院）；磷霉素（FOS，Sigma公司）。營養瓊脂平板（重慶龐通醫藥器材公司）；MH培養基（北京陸橋生物技術有限公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（英國Oxoid公司）。VITEK－2型全自動細菌分析儀（法國生物梅里埃公司）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 MIC和FICI檢測

抗菌藥物對銅綠假單胞菌的 MIC檢測采用微量肉湯稀釋法。細菌劃線接種于營養瓊脂平板上，37℃培養過夜；挑取菌落于0.9%氯化鈉注射液3～5 mL校正濃度至0.5麥氏比濁標準，再用MH肉湯稀釋成1∶100，使含菌量為106cfu／mL。抗菌藥物用MH肉湯2倍稀釋成一系列質量濃度（0.5～1 024.0 μg／mL）。然后每孔加100 μL菌液和100 μL系列質量濃度的抗菌藥物，使得藥物最終質量濃度為0.255～12.0 μg／mL。96孔板置37℃培養箱孵育16～20 h后觀察結果。

FICI測定采用棋盤法。FICI＝環丙沙星聯合時的 MIC／環丙沙星單用時的 MIC＋磷霉素聯合時的 MIC／磷霉素單用時的MIC。FICI≤0.5為協同作用，0.5＜FICI≤4.0為無關作用，FICI＞4.0為拮抗作用。

1.2.2 殺菌作用

選取環丙沙星和磷霉素聯合應用時，協同作用和環丙沙星MIC降低均最明顯的銅綠假單胞菌P34和P58作為研究對象。細菌首先接種于LB平板，37℃培養18 h；分別挑取單菌落于10 mL LB培養基，37℃恒溫震蕩培養18 h；取100 μL過夜培養物轉接于10 mL LB培養基，37℃、200 r／min下震蕩培養2 h。每個菌株均分為空白對照組、環丙沙星組、磷霉素組、環丙沙星＋磷霉素組。空白對照組不加藥物，其他各組藥物的終濃度均為1／2 MIC。然后分別于0，2，4，6，8，10 h時取樣100 μL，菌液適當稀釋后均勻涂布于LB平板上，37℃培養過夜后進行菌落計數。所有試驗均重復3次。

1.2.3 濁度試驗

分別取銅綠假單胞菌P34和P58的上述過夜培養物100 μL，轉接于10 mL LB培養基，在37℃及200 r／min下振蕩培養2 h。試驗分為空白對照組、環丙沙星組、磷霉素組、環丙沙星＋磷霉素組。環丙沙星和磷霉素藥物終濃度均為1／2 MIC。細菌分組處理后分別于每1 h取樣100 μL，連續取樣9 h，用酶標儀檢測其在570 nm波長處的吸光度值（OD570）。

2 結果

2.1 兩藥聯用的FICI測定結果

82株耐環丙沙星銅綠假單胞菌中，FICI≤0.5者 22株（26.83%），0.5＜FICI≤4.0者60株（73.17%），FICI＞4.0者0株（0）。環丙沙星和磷霉素聯合對耐環丙沙星銅綠假單胞菌均無拮抗作用。

2.2 兩藥聯用對銅綠假單胞菌的殺菌作用

結果見表1和圖1。聯合用藥后，環丙沙星對銅綠假單胞菌P34和P58的 MIC降低至不超過8 μg／mL，聯合用藥對這兩株菌的FICI分別為0.250和0.375，具有較好的協同作用。菌株P34在8 h時，空白對照組的細菌數為lg 9.2 cfu／mL，環丙沙星和磷霉素單獨處理組分別為lg 7.2和lg 7.0 cfu／mL，而環丙沙星和磷霉素聯合處理組為lg 3.5 cfu／mL。菌株P58在8 h時，空白對照組的細菌數為lg 9.6 cfu／mL，環丙沙星和磷霉素單獨處理組分別為lg 7.4 cfu／mL和lg 7.8 cfu／mL，而環丙沙星和磷霉素聯合處理組為lg 4.7 cfu／mL。

表1 環丙沙星與磷霉素單用和聯用對銅綠假單胞菌P34和P58的 MIC和FICI

2.3 兩藥聯用對細菌濁度的影響

聯合用藥對細菌濁度的影響見圖2。菌株P34和P58分組培養3 h后，聯合用藥組的細菌濁度顯著低于單獨用藥組。

圖1 環丙沙星與磷霉素聯用對銅綠假單胞菌的殺菌作用

圖2 環丙沙星與磷霉素聯用對細菌濁度的影響

3 討論

銅綠假單胞菌是院內感染的重要條件致病菌，是引起免疫抑制、惡性腫瘤、囊性纖維化、燒傷及尿路感染患者死亡的重要原因［10］。在銅綠假單胞菌引起的尿路感染患者中，敏感菌株引起的死亡率達23%，而多重耐藥菌株引起的死亡率高達67%［11］。因此，多重耐藥銅綠假單胞菌的出現為尿路感染患者的治療帶來了巨大挑戰。國內外均有研究［10，12－13］表明，不同種類抗菌藥物聯合應用抗銅綠假單胞菌具有協同作用。本試驗中，環丙沙星和磷霉素聯合應用后，對22株（26.83%）耐環丙沙星銅綠假單胞菌表現出協同作用，無拮抗作用，與國外研究［9］報道基本一致。這表明抗菌藥物聯合應用后，對銅綠假單胞菌的抑制作用顯著優于單一抗菌藥物的使用。銅綠假單胞菌的一個固有耐藥性是其細胞壁具有低滲透性，從而能限制抗菌藥物的進入。聯合抗菌藥物對銅綠假單胞菌生長的影響試驗表明，環丙沙星和磷霉素聯合應用比單獨使用具有更好的殺菌效果和溶菌作用。這可能是由于環丙沙星能破壞細菌的細胞壁，而磷霉素可增加細胞壁的滲透作用。Hiromi等［14］和Koichi等［15］報道，氧氟沙星和磷霉素聯用抗銅綠假單胞菌具有協同作用。這充分表明磷霉素能通過影響細胞壁合成來改變銅綠假單胞菌的膜滲透性。近年來，多重耐藥銅綠假單胞菌引起的尿路感染患者數量不斷增加，然而臨床幾乎無有效的抗菌藥物可對抗這些耐藥菌株。本研究結果為磷霉素和環丙沙星聯合應用對尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的協同抗菌作用研究和開發更為有效的治療方案提供了線索，但仍需進一步深入研究。

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On the In Vitro Synergistic EffectofCiprofloxacin Combined with Fosfomycin against Drug-Resistant Pseudomonas Aeruginosa Isolates from Urinary Tract Infections

Song Jie1，He Zhaoyun2，Gong Haiyan1，Xu Siquan1，Chen Xianhua1
（1.Department of Prevention and Health Care，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，China 400038；
2.Liver Cirrhosis Diagnosis and Therapy Center，302 Hospital of PLA，Beijing，China 100039）

ObjectiveTo investigate the in vitro synergistic effect of ciprofloxacin combined with fosfomycin on ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from urinary tract infections.MethodsThe isolation and identification of Pseudomonas aeruginosa were performed by using the traditional procedures.The minimum inhibitory concentration（MIC）testing was determined by using the microdilution broth method.The fractional inhibitory concentration index（FICI）was tested by using the checkerboard method.ResultsAmong the 82 ciprofloxacin-resistantPseudomonas aeruginosa isolates，the synergistic effect of ciprofloxacin combined with fosfomycin was observed in 22 strains（26.83%）.In the acute bactericidal effect experiments，Pseudomonas aeruginosa isolates P34 and P58 as the most obvious synergistic effect and the reduced MIC of ciprofloxacin were selected as the research subjects.The results showed that the viable cell count at 8 h after medication treatment in the ciprofloxacin and fosfomycin combination treatment group was significantly fewer than that of the single drug treatment group.The turbidity test results showed that the significant difference at 3 h after medication treatment was observed between the ciprofloxacin and fosfomycin combination treatment group and the single drug treatment group.ConclusionThe combination of ciprofloxacin and fosfomycin not only induces a synergistic effect on ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa strains，but also has a strong bactericidal effect and bacteriolytic effect.

urinary tract infections；ciprofloxacin；fosfomycin；Pseudomonas aeruginosa；synergistic effect

R915；R969.3；R978.69

A

1006－4931（2015）02－0036－03

宋潔（1981－），女，主管醫師，主要從事預防保健工作，（電子信箱）song＿songjie＠163.com。

2014－07－28）