棗仁安神顆粒改善睡眠作用的量效、時(shí)效關(guān)系及對(duì)腦內(nèi)細(xì)胞因子的影響*

張 穎，齊 越，吳 怡，秦文艷，朱竟赫，孟 莉，尤獻(xiàn)民

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

棗仁安神顆粒改善睡眠作用的量效、時(shí)效關(guān)系及對(duì)腦內(nèi)細(xì)胞因子的影響*

張 穎，齊 越，吳 怡，秦文艷，朱竟赫，孟 莉，尤獻(xiàn)民

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

目的 研究棗仁安神顆粒改善睡眠作用的量效、時(shí)效關(guān)系，及對(duì)小鼠腦內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的影響。方法 采用戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗(yàn)方法，以睡眠時(shí)間為指標(biāo)，研究棗仁安神顆粒改善睡眠作用的量效、時(shí)效關(guān)系；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定小鼠全腦白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的含量。結(jié)果 棗仁安神顆粒改善睡眠作用最短起效時(shí)間為連續(xù)給藥5 d；最佳給藥劑量為2 080 mg／kg，在劑量為4 160 mg／kg時(shí)藥效減弱，表現(xiàn)為復(fù)雜的量效關(guān)系；給予棗仁安神顆粒2 080 mg／kg后，小鼠全腦IL－1β和TNF－α的含量明顯降低。結(jié)論 棗仁安神顆粒改善睡眠作用時(shí)效關(guān)系明顯、量效關(guān)系復(fù)雜，其改善睡眠作用由細(xì)胞因子介導(dǎo)。

棗仁安神顆粒；睡眠；白細(xì)胞介素－1β；腫瘤壞死因子－α

棗仁安神顆粒由酸棗仁、丹參、五味子3味中藥組方，具有補(bǔ)心養(yǎng)肝、安神益智的功效，對(duì)由心肝血虛、神經(jīng)衰弱引起的失眠、健忘、頭暈、頭痛有良好的治療作用［1］。前期研究表明，棗仁安神顆粒有協(xié)同戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時(shí)間的作用，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為斯皮諾素、丹酚酸B和五味子甲素等［2］。藥理研究發(fā)現(xiàn)，睡眠時(shí)腦內(nèi)產(chǎn)生多種物質(zhì)，缺乏睡眠時(shí)這些物質(zhì)又有不同的改變，由此調(diào)節(jié)和影響著睡眠；這些物質(zhì)包括細(xì)胞因子，其中研究較多的細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）和腫瘤壞死因子－α（TNF－α），各種電生理、生化和分子基因?qū)W方面的試驗(yàn)都證明了兩者在正常生理性睡眠（自發(fā)性睡眠）中的調(diào)節(jié)作用［3－4］。本研究中旨在對(duì)棗仁安神顆粒改善睡眠作用的量效、時(shí)效關(guān)系進(jìn)行研究，并對(duì)其影響小鼠腦內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行初步分析。

1 動(dòng)物、試劑與方法

1.1 材料

動(dòng)物：昆明種小鼠，SPF級(jí)，18～22 g，雌性，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK（遼）2010－0001。受試動(dòng)物引進(jìn)后在遼寧省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)觀察1周，實(shí)驗(yàn)室溫度為20～25℃，實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度為50%～60%。

藥物與試劑：棗仁安神顆粒（遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)室提供，批號(hào)為20130401）；地西泮片（上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)為121201）；戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)為060222，用時(shí)用0.9%氧化鈉注射液溶解配制），0.9%氧化鈉注射液（華仁藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為Q1303050）。IL－1β和TNF－α試劑盒均購于美國R＆D公司。

藥液配制：棗仁安神顆粒提取物臨用前用蒸餾水溶解，分別配制成質(zhì)量濃度分別為208，104，52，26，13 g／L的溶液。

1.2 方法

改善睡眠作用的量效關(guān)系研究：選取健康SPF級(jí)昆明種小白鼠60只，體重18～22 g，雄性，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只。分別灌胃給予上述不同質(zhì)量濃度的棗仁安神顆粒提取物，每10 g體重0.2 mL，即劑量為4 160，2 080，1 040，520，260 mg／kg，空白組給予同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃7 d，于末次給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg／kg，從開始注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失的時(shí)間為入睡潛伏期，從翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)的時(shí)間為睡眠時(shí)間。記錄各組小鼠入睡的潛伏期和睡眠時(shí)間，組間行t檢驗(yàn)。

改善睡眠作用的時(shí)效關(guān)系研究：試驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為5組，每組10只。給藥組灌胃給予棗仁安神顆粒提取物溶液 2 080 mg／kg，連續(xù)灌胃時(shí)間分別為3，5，7，9 d。空白組給予同體積的蒸餾水，末次給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg／kg，分別記錄各組入睡的潛伏期和睡眠時(shí)間。

對(duì)小鼠全腦IL－1β和TNF－α含量的影響：分組、給藥方法同上。末次給藥（水）30 min后，斷頭處死，冰浴上剝離全腦，濾紙吸干殘留血液，快速稱重。用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）研磨，4℃3 000 r／min，離心10 min，取上清液，酶標(biāo)儀分別測定IL－1β和TNF－α的光密度，采用外標(biāo)法計(jì)算含量（具體步驟詳見試劑盒說明書）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 改善睡眠作用的量效關(guān)系

結(jié)果見表1。可見在一定劑量范圍內(nèi)，棗仁安神顆粒改善睡眠作用的最佳劑量為2 080 mg／kg，主要表現(xiàn)為延長戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間（P＜0.01），縮短潛伏期（P＜0.05）。低于或高于此劑量，催眠作用消失，表現(xiàn)出復(fù)雜的量效關(guān)系。

2.2 改善睡眠作用的時(shí)效關(guān)系

結(jié)果見表2。可見棗仁安神顆粒（2 080 mg／kg）連續(xù)給藥5 d時(shí)開始起效，表現(xiàn)為能延長小鼠的睡眠時(shí)間，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05）；連續(xù)給藥7 d和9 d時(shí)，與空白組比較，小鼠的睡眠時(shí)間和入睡潛伏期表現(xiàn)為顯著差異（P＜0.05）。

表1 棗仁安神顆粒改善睡眠作用的量效關(guān)系（±s，n＝10）

表1 棗仁安神顆粒改善睡眠作用的量效關(guān)系（±s，n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，＃P＜0.01。下表同。

組別給藥組空白組劑量（mg／kg）4 160 2 080 1 040 520 260－入睡潛伏期（s）203.8±23.96 189.5±27.51*223.4±39.73 209.5±13.66 222.9±12.20 216.0±28.73睡眠時(shí)間（min）25.80±12.10 73.10±31.15＃44.70±21.12 45.90±38.28 41.20±26.12 29.40±7.43

表2 棗仁安神顆粒改善睡眠作用的時(shí)效關(guān)系（±s，n＝10）

表2 棗仁安神顆粒改善睡眠作用的時(shí)效關(guān)系（±s，n＝10）

組別給藥組 給藥3 d給藥5 d給藥7 d給藥9 d空白組劑量（mg／kg）2 080－入睡潛伏期（s）195.0±37.03 205.6±32.84 183.5±32.34*188.6±26.51*218.6±34.35睡眠時(shí)間（min）57.50±14.43 64.10±15.29*63.80±11.90*66.20±13.81*44.90±22.61

2.3 對(duì)小鼠全腦IL－1β和TNF－α含量的影響

結(jié)果見表3。可見灌胃給予小鼠棗仁安神顆粒2 080 mg／kg，連續(xù)7 d，能顯著降低小鼠全腦IL－1β和TNF－α含量，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 棗仁安神顆對(duì)小鼠全腦IL－1β和TNF－α含量的影響（±s，ng／L，n＝10）

表3 棗仁安神顆對(duì)小鼠全腦IL－1β和TNF－α含量的影響（±s，ng／L，n＝10）

組別空白組給藥組IL－1β 467.6±80.33 382.4±46.99*TNF－α 3537±172 3377±147*

3 討論

對(duì)于單一成分的藥物，在一定范圍內(nèi)增加劑量，其藥理作用也會(huì)隨之增強(qiáng)。但對(duì)于多種成分的藥物，隨著劑量的增加，其不同成分藥理作用的增強(qiáng)幅度不一定相同，集合起來的藥理作用就會(huì)與實(shí)際劑量的比值、閾劑量、對(duì)藥效的增強(qiáng)幅度有關(guān)，在一定范圍內(nèi)其藥理作用可能相互抵消，或增強(qiáng)或減弱一方的作用。因此，中藥理論中常有“小劑量、大劑量”藥理作用相反的現(xiàn)象發(fā)生［5］。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，棗仁安神顆粒灌胃給藥最佳劑量為2 080 mg／kg，給藥劑量增加到4 160 mg／kg時(shí)藥效反而減弱，表現(xiàn)出復(fù)雜的量效關(guān)系。

在正常睡眠過程中，人體細(xì)胞因子的分泌有一定的晝夜節(jié)律性。有研究證明，細(xì)胞因子IL－1，IL－6及TNF在夜間睡眠時(shí)增加且具有催眠作用，TNF和IL－1共同調(diào)節(jié)生理性睡眠；另外，TNF－α mRNA，IL－1β mRNA及相應(yīng)的受體能在腦中表達(dá)，同時(shí)其水平呈明顯的晝夜節(jié)律性；但也有相反的報(bào)道，動(dòng)物在蘇醒時(shí)TNF－α和IL－1β明顯升高，出現(xiàn)此結(jié)果可能由于睡眠剝奪所致［6］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，棗仁安神顆粒連續(xù)灌胃7 d，能顯著降低小鼠全腦 IL－1β和 TNF－α含量。文獻(xiàn)［7］報(bào)道，IL－1β和TNF－α在睡眠期應(yīng)顯著升高，主要發(fā)生在丘腦下部、海馬等部位，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，分析原因可能是取材部位不同，本試驗(yàn)測定部位為全腦。

參考文獻(xiàn)：

［1］WS3－B－2164－96，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十一冊(cè)）［S］.

［2］Zhang Y，Diao YP，You XM，et al.Quality assessment of Zaoren an shen granule by High－performance liquid chromatography fingerprinting and quantitative analysis［J］.J Med Plant Res，2010，4（16）：1 628－1 636.

［3］王春燕，趙忠新.細(xì)胞因子與睡眠／剝奪的研究進(jìn)展［J］.腦與神經(jīng)疾病雜志，2004，12（2）：154－157.

［4］陳 睿，趙忠新.IL－1β及TNF－α對(duì)非快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，35（8）：1 032－1 034.

［5］段金廒，范欣生，宿樹蘭，等.論中藥雙向調(diào)節(jié)作用機(jī)理［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，18（6）：15－17.

［6］史智勇，趙紅斌.細(xì)胞因子對(duì)睡眠的影響［J］.國外醫(yī)學(xué)：生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2000，20（4）：282－284.

［7］Lym C，Ping TS，Wang MF，et al.Brain distribution of cytokine mRNA induced by systemic administration of interleukin－1β or tumor necrosis factor α［J］.Brain Res，2006，1 120（1）：64－73.

Dose-Effect and Time-Effect Relationship of Improving Sleep Effect of Zaoren Anshen Granules and Its Influence on Mice Brain Cell Factors

Zhang Ying，Qi Yue，Wu Yi，Qin Wenyan，Zhu Jinghe，Meng Li，You Xianmin
（Liaoning Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Shenyang，Liaoning，China 110034）

ObjectiveTo study the dose-effect and time-effect relationships of Zaoren Anshen Granules for improving sleep effect and its influence on related mice brain cytokines.MethodsThe pentobarbital sodium（PS）collaborative sleep experiment was adopted to research the dose-effect and time-effect relationship of Zaoren Anshen Granules for improving sleep effect with the sleep time as the index；the enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）was used to determine the contentofIL-1β and TNF-α in mice brain.ResultsThe shortest effective onset time of Zaoren Anshen Granules for improving sleep was 5 d continuous administration；the optimal dose was 2 080 mg／kg；at the dose of 4 160 mg／kg，the drug effect was weakened，which was manifested by the complex dose-effect relationship；the content of IL-1β and TNF-α in mice whole brain was decreased obviously after administrating the dose of 2 080 mg／kg Zaoren Anshen Granules.ConclusionZaoren Anshen Granule improves sleep with obvious time-effect and complex dose-effect relationship，its effect for improving sleep might be mediated by the cytokines.

Zaoren Anshen Granules；sleep；IL-1β；TNF-α

R285.5；R286

A

1006－4931（2015）02－0032－03

張穎（1979－），女，博士研究生，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評(píng)價(jià)，（電子信箱）xuanxuanzy＠163.com；尤獻(xiàn)民（1964－），男，大學(xué)本科，研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)，本文通訊作者，（電子信箱）youxianmin1120＠126.com。

2014－04－30）

*遼寧省科技廳博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：20121099。