正交試驗法優化海洋星蟲多糖堿提法提取工藝*

劉玉明，錢甜甜，蔣定文，何 穎，沈先榮，李珂嫻，陳 偉，侯登勇，劉 瓊，王慶蓉，羅 群，江叔奇

（1.中國人民解放軍海軍醫學研究所，上海 200433； 2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

正交試驗法優化海洋星蟲多糖堿提法提取工藝*

劉玉明1，錢甜甜1，蔣定文1，何 穎1，沈先榮1，李珂嫻1，陳 偉1，侯登勇1，劉 瓊1，王慶蓉1，羅 群1，江叔奇2

（1.中國人民解放軍海軍醫學研究所，上海 200433； 2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

目的 優選海洋星蟲多糖的提取工藝。方法 以料液比、NaOH濃度、提取溫度、提取時間為考察因素，以多糖含量與多糖得率的乘積為評價指標，采用正交試驗法優選海洋星蟲多糖的提取工藝。結果 海洋星蟲多糖的最佳工藝條件為料液比1∶4，NaOH濃度為1%，溫度60℃，時間4 h。結論 該提取工藝簡便、快捷，可用于海洋星蟲多糖的提取。

海洋星蟲多糖；提取工藝；正交設計

海洋星蟲 Sipunculusnudus Linnaeu.俗稱沙蟲、海蠶沙、海蠶、沙腸子、海腸子、星蟲，是星蟲動物門方格星蟲目方格星蟲科方格星蟲屬裸體方格星蟲的全體，資源豐富，在我國沿海北至渤海灣南至北部灣以及海南、臺灣等地均有分布。海洋星蟲的保健功能在我國古代醫藥專著中多有記載，著名本草學家李時珍的《本草綱目》中記載有“海蠶”的藥用功效。中醫認為，海洋星蟲性味甘、咸、寒，具清肺補虛、滋陰降火功效，臨床用于骨蒸潮熱、陰虛盜汗、肺虛咳喘、胸悶痰多等疾病，著名本草學家李荀的《海藥本草》中記載：“海蠶沙味咸，大溫，無毒。主虛勞冷氣，褚風不遂。久服令人光澤，補虛羸，輕身，延年不老。”海洋星蟲含有豐富的多糖、蛋白質、微量元素等多種活性物質［1］，前期藥效學研究結果表明，海洋星蟲多糖在提高免疫［2］、抗疲勞［3］、促智［4］等方面有顯著作用。為了進一步深入研究海洋星蟲提取物中多糖的藥理作用，本研究中采用正交試驗設計法對海洋星蟲多糖的提取工藝進行優化，并對其多糖含量和得率進行了測定，旨在為進一步最大限度地利用星蟲的有效成分奠定基礎，也為海洋星蟲多糖的新藥申報提供實驗室依據。

1 儀器與試藥

高速組織搗碎儀（上海精科實業有限公司）；HetoLyolab 3000型冷凍干燥機；循環水式多用真空泵SHB－ⅢA（上海預康科教儀器設備有限公司）；全不銹鋼電動多用絞切機（江蘇省丹徒縣民用設備廠）；旋轉蒸發器（上海申勝生物技術有限公司）；85－2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；SJ3200型超聲波清洗機（上海潔凈超聲波設備廠）；膠體磨型廊坊通用機械廠；電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）；GL－21M型離心機（上海市離心機械研究所）。葡萄糖（AR級，上海化學試劑分裝廠，批號為0690404；蒽酮（批號為20080618），氫氧化鈉（批號為F20080921），鹽酸（批號為T050704），濃硫酸（均為AR級，中國醫藥集團上海化學試劑公司產品；批號為 20020412）；三氯乙酸（進口分裝，批號為LJ0810B508J）；95%醫用乙醇（上海勝德化工有限公司，批號為F20080921）。新鮮海洋星蟲購自廣西北海，由上海海洋大學水產與生命學院進行藥材鑒定。

2 方法與結果

2.1 海洋星蟲多糖的提取

分別稱取海洋星蟲原料50 g，浸泡過夜，清洗，先用大型剪切機切碎（重復2次），分別按照設定好的料液比、NaoH濃度、提取溫度、提取時間進行提取，以9 000 r／min的速率離心30 min，棄去沉淀，得上清液。將各上清液調pH至7.0，攪拌下加三氯乙酸至pH＝4，以9 000 r／min的速率離心30 min，得上清液。上清液加入95%醫用乙醇，使乙醇終濃度為75%，4℃靜置12 h，9 000 r／min的速率離心30 min，取沉淀，用75%醫用乙醇洗滌沉淀3次，干燥，得海洋星蟲多糖。

2.2 多糖含量測定方法的建立［5］

溶液制備：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品50 mg，置500 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。分別取擬訂工藝制備的海洋星蟲多糖20 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

標準曲線制備：分別精密吸取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸－蒽酮溶液6 mL，搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、質量，濃度為橫坐標。得標準曲線，回歸方程為 Y＝50.576 X＋0.0281，R2＝0.9967（n＝6）。結果表明，用0.1%硫酸－蒽酮溶液顯色后，葡萄糖質量濃度在0.02～1.2 g／L范圍內與吸光度呈良好線性關系。

測定法：精密稱取所制備的多糖提取物各3份，每份20 mg，分別置100 mL容量瓶中，加水使溶解，搖勻，精密量取0.4 mL溶液，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下方法，同法操作，依法測定吸光度，并從標準曲線上計算供試品溶液中多糖含量。2.3 海洋星蟲固體得率測定

取各提取工藝條件下所制備的海洋星蟲多糖提取物，置烘箱中105℃烘5 h，移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱定質量，再在105℃干燥1 h，冷卻，稱重，至恒重，計算總固體得率。

2.4 正交試驗優化提取工藝

試驗設計：稱取星蟲原料50 g，共9份，編號，泡水過夜，洗凈，切碎，組織勻漿。以干浸膏得率和多糖含量為考察指標，考察料液比（因素A）、NaOH濃度（因素B）、提取溫度（因素C）、提取時間（因素D）對提取工藝的影響，并對提取工藝進行優選，從而確定堿提法最佳提取工藝。采用 L9（34）正交表進行試驗，試驗因素與水平見表1，最終得9份海洋星蟲多糖。

表1 正交試驗因素水平

結果：分別對正交試驗所得的9份樣品，按照2.2及2.3項下方法進行含量測定和得率計算，并以含量與得率的乘積為評價指標。結果見表2。

統計分析：以多糖含量與得率的乘積為評價指標，分別對正交試驗結果分析，其直觀分析表見表2，方差分析見表3。根據正交試驗方差分析結果，影響星蟲多糖產率因素的大小順序是B＞A＞D＞C，即NaOH濃度＞料液比＞時間＞溫度。直觀分析，提取星蟲粗多糖的最佳工藝條件為A2B3C3D3，即料液比1：4、NaOH濃度1%、溫度60℃、時間4 h。

2.5 星蟲多糖中試生產驗證試驗

為了進一步驗證上述工藝，分3次對星蟲多糖進行批量提取，并對提取物進行多糖含量和得率計算。

分別稱取海洋星蟲原料3份，浸泡過夜，清洗，先用大型剪切機切碎（重復2次），加入4倍量水在膠體磨勻漿，加入1% NaOH，60℃提取4 h，以9 000 r／min的速率離心30 min，棄去沉淀，得上清液。將各上清液調pH至7.0，攪拌下加三氯乙酸至pH＝4，以9 000 r／min的速率離心30 min，得上清液。上清液加入95%醫用乙醇使乙醇終濃度為75%，4℃靜置12 h，以9 000 r／min的速率離心30 min，取沉淀，用75%醫用乙醇洗滌沉淀3次，干燥，得海洋星蟲多糖。對粗多糖進行含量測定和得率計算，結果見表4。可見，優選工藝提取簡單、可行、重復性好，符合實際生產要求。

3 討論

海洋星蟲主要棲息于沿海潮間帶灘涂區以及淺海泥沙質或沙質海底，以低潮處最多，呈穴居，在我國具有廣泛的自然資源，并具有廣泛的應用保健價值，在民間素有“動物人參”“海洋里的冬蟲夏草”的美譽。因此，如何有效地對海洋星蟲多糖進行提取和制備，對于海洋星蟲的深入開發具有重要意義。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析表

動物多糖有多種提取方法，如熱水浸提法、堿浸提法以及酶解提取法，本研究中通過正交設計法優化出海洋星蟲多糖堿提法的最佳提取工藝。堿溶液的濃度和提取溫度對多糖的結構和提取效率具有重要的影響，在提取過程中應盡量控制NaOH濃度和提取溫度，以免破壞其結構。

［1］劉玉明，錢甜甜，何 穎，等.方格星蟲多糖不同提取工藝的比較研究［J］.時診國藥國藥，2011，22（6）：1 454－1 455.

［2］李珂嫻，沈先榮，何 穎，等.方格星蟲多糖對小鼠免疫功能的影響［J］.中國海洋藥物，2012，31（1）：46－49.

［3］劉玉明，錢甜甜，莫琳芳，等.方格星蟲多糖對運動小鼠抗疲勞實驗研究［J］.中國海洋藥物，2012，31（3）：42－44.

［4］何 穎，沈先榮，蔣定文，等.方格星蟲多糖對記憶障礙小鼠學習記憶能力的影響［J］.中國海洋藥物，2012，31（1）：38－42.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：化學工業出版社，2005：130.

Optimization of Alkali Extraction Method of Sipunculusnudus Polysaccharide by Orthogonal Experiment

Liu Yuming1，Qian Tiantian1，Jiang Dingwen1，He Ying1，Shen Xianrong1，Li Kexian1，Chen Wei1，Hou Dengyong1，Liu Qiong1，Wang Qingrong1，Luo Qun1，Jiang Shuqi2

ObjectiveTo optimize the extraction technology of polysaccharide from Sipunculusnudus Linnaeu.MethodsThe extraction technology of the sipunculusnudus polysaccharide was optimized by the orthogonal design with the solid－liquid ratio，sodium hydroxide concentration，extraction temperature and extraction time as the investigation factors and the product of the polysaccharide content and the polysaccharide yield as the evaluation index.ResultsThe optimal extraction technology of the sipunculusnudus polysaccharide was as follows：the solid－liquid ratio was 1∶4，the concentration of sodium hydroxide was 1%，the extraction temperature was 60℃ and the extraction time was 4 h.ConclusionThis extraction technology is simple and rapid，which can be applicable for the extraction of the sipunculusnudus polysaccharide.

Sipunculusnudus polysaccharide；extraction technology；orthogonal design

表4 批量生產驗證試驗結果

TQ461；R284.1；R282.77

A

1006－4931（2015）02－0021－02

劉玉明，博士研究生，副研究員，主要從事藥物核輻射防護及中藥現代化研究工作，（電話）021－81883886；沈先榮，博士研究生，研究員，主要從事海洋藥物在核輻射損傷和核事故應急中的防護研究工作，本文通訊作者，（電話）021－81883871。

2014－07－28）

*國家科技重大專項新藥創制項目，項目編號：2008ZXJ09004－027。

（1.Naval Medical Research Institute，Shanghai，China 200433；2.Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou，Zhejiang，China 310053）