標本放置時間對PL-11檢測血小板功能的影響

朱 遠，關 杰，田月強，李 莉，平牧野，任軍偉，鄧新立，叢玉隆

1解放軍總醫院 南樓檢驗科，北京 100853；2北京大學第一醫院 檢驗科，北京 100034；3兵器工業北京北方醫院 檢驗科，北京 100089

標本放置時間對PL-11檢測血小板功能的影響

朱 遠1，關 杰2，田月強1，李 莉1，平牧野1，任軍偉3，鄧新立1，叢玉隆1

1解放軍總醫院 南樓檢驗科，北京 100853；2北京大學第一醫院 檢驗科，北京 100034；3兵器工業北京北方醫院 檢驗科，北京 100089

目的探討標本在室溫保存時，不同放置時間對血小板功能檢測儀PL-11結果的影響。方法采集我院2012級學員隊20位健康學員及2013年我院門診20位服用氯吡格雷和阿司匹林的冠心病患者肘靜脈枸櫞酸鈉抗凝全血，應用PL-11分別在采血后不同保存時間點(2 h、4 h、8 h)測定不同血小板活化誘導劑誘導的血小板聚集率。結果健康組：以花生四烯酸(arachidonic acid，AA)為血小板活化誘導劑時，2 h、4 h、8 h的放置時間對血小板聚集功能未產生影響(P＞0.05)；二磷酸腺苷(adenosine di-phosphate，ADP)為誘導劑時，血小板聚集率在4 h明顯降低(P＜0.01)，8 h時已經降低至4.3%(P＜0.01)；膠原(collagen，Col)誘導的血小板聚集率在采血后4 h時較2 h明顯降低(P＜0.01)，但與8 h差異無統計學意義(P＞0.05)。服用抗血小板藥物組：AA誘導的血小板聚集率2 h、4 h、8 h兩兩差異均無統計學意義(P＞0.05)，ADP誘導的血小板聚集率在4 h時明顯降低(P＜0.01)，4 h與8 h差異無統計學意義(P＞0.05)，Col誘導的血小板聚集率在8 h后出現明顯降低(P＜0.01)。結論枸櫞酸鹽抗凝血標本采集后放置時間對PL-11血小板功能檢測存在影響，在檢測健康人組或已服用雙聯抗血小板藥物患者組時，AA誘導血小板聚集受時間影響較小，ADP與膠原誘導血小板聚集時隨著標本放置時間延長，血小板聚集率降低。結合凝血功能檢測對枸櫞酸鹽抗凝血的要求，PL-11檢測血小板功能時，AA誘導聚集可在采血后4 h內完成，ADP與膠原誘導應在采血后2 h內完成。

血小板聚集功能；質量控制；PL-11；放置時間

冠心病患者在服用抗血小板藥物治療時，實驗室可以進行血小板功能檢測以監測抗血小板治療。血小板功能檢測儀PL-11是一種通過庫爾特原理連續計數活化前后血小板數來評估血小板功能的檢測方法。目前已有研究認為該方法可監測抗血小板治療[1-2]，但尚無對該方法質量控制方面的報道。本研究通過分析不同標本放置時間對PL-11檢測血小板功能的影響，為PL-11血小板功能分析質量控制提供試驗依據。

資料和方法

1 對象 征集我院2012級學員隊男學員20名，平均年齡(28.6±6.1)歲，平均血小板數(215.7± 58.8)×109/L。另選擇2013年我院心內科門診確診為冠心病并同時服用阿司匹林及氯吡格雷的男性患者20例，平均年齡(62.4±13.9)歲，平均血小板數(217.4±71.0)×109/L。

2 儀器與試劑 南京英諾華醫療科技有限公司的PL-11血小板功能分析儀及配套花生四烯酸試劑(arachidonic acid，AA)(濃度2 g/L)，二磷酸腺苷試劑(adenosine di-phosphate，ADP)(1 mmol/L)，膠原試劑(collagen，Col)(2 mg/ml)；真空采血管為3.2%枸櫞酸鹽抗凝管，購自美國B.D公司；1 ml移液槍，200μl移液槍。

3 標本采集與檢測 采集每位受試者3管枸櫞酸鹽抗凝全血，置于室溫保存，分別在采血后2 h、4 h、8 h使用PL-11對標本進行測試。吸取0.5 ml枸櫞酸鹽抗凝全血至PL-11檢測試管開始檢測。PL-11在計數血小板基礎值后，自動加入一種血小板活化誘導劑(ADP 40μl最終濃度：4 mmol/L；AA 25μl最終濃度：0.3 mmol/L；Col 40μl，最終濃度：0.16 mg/L)，間隔一定混勻時間后連續進行血小板計數，得到最低血小板計數值，結果以最大血小板聚集率表示。

4 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。檢測數據以表示，多組數據間比較使用ONE-WAY ANOVA方差分析方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

兩組血小板聚集率，健康對照組由AA誘導的PL-11最大血小板聚集率(%)分別為82.7%±7.2% (2 h)、82.8%±7.5%(4 h)、75.8%±14.6%(8 h)，不同放置時間最大血小板聚集率差異無統計學意義(P＞0.05)；由ADP誘導的最大血小板聚集率(%)分別為70.6%±7.8%(2 h)、58.8%±9.8%(4 h)、4.3%±0.4%(8 h)，各時間點間差異有統計學意義(P＜0.01)；由Col誘導的最大血小板聚集率(%)分別為75.1%±7.9%(2 h)、50.1%±16.1%(4 h)、45.1%± 14.4%(8 h)，2 h與4 h，2 h與8h間差異有統計學意義(P＜0.01)。抗血小板藥物組，由AA誘導的PL-11最大血小板聚集率(%)分別為30.1%±11.0% (2 h)、27.3%±8.9%(4 h)、26.3%±7.9%(8 h)，不同時間差異無統計學意義(P＞0.05)；由ADP誘導的最大血小板聚集率(%)分別為48.2%±10.9%(2 h)、34.8%±12.1%(4 h)、28.5%±6.5%(8 h)，2 h與4 h，2 h與8 h間差異有統計學意義(P＜0.01)；由Col誘導的最大血小板聚集率(%)分別為41.3%±15.2% (2 h)、35.3%±10.5%(4 h)、30.5%±7.1%(8 h)，僅2 h與8 h間差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖1。

圖 1 放置時間對血小板聚集率的影響Fig. 1 Effects of storage time on platelet aggregation A: healthy group; B: treatment group,aP＜0.01

討 論

20世紀初，Duke[3]首次利用出血時間間接檢評估小板功能。后來的研究認識到在病理狀態下，活化的血小板和內皮細胞之間相互作用[4]，血流切變力增高(＞5 000/s)等因素，均可直接活化血小板，引起該部位血小板活化誘導劑的形成與釋放，包括花生四烯酸經環氧化酶(COX)作用形成的血栓烷A2(TxA2)、二磷酸腺苷和膠原等，最終形成血栓。因此檢測血小板功能成為了解血栓風險和監測抗血小板治療的一種方法。PL-11是一種通過計數血小板活化前后數量來判斷血小板聚集功能的檢測方法。目前已有文獻報道該方法與經典光比濁法在監測抗血小板治療時具有較好相關性及重復性[1-2,5-6]，但PL-11的檢測前質量控制如標本放置時間、放置溫度、試劑濃度等對檢測結果的影響尚未有報道。本文主要研究樣本在檢測前放置時間對PL-11的影響。

光比濁法檢測血小板功能應在室溫進行，檢測時間最好為采血后30 min ～ 2 h，不能超過4 h[7-8]。因此我們研究了在2 h、4 h、8 h時PL-11檢測血小板聚集功能的差異。結果發現，當AA為血小板活化誘導劑時，血標本放置2 h、4 h、8 h后血小板聚集率無明顯差異，因此對于AA為誘導劑的血小板功能檢測時血液標本保存可在4 h內檢測。當以ADP為誘導劑時，我們發現血小板聚集率在4 h明顯降低，8 h時已經降低至4.3%。這可能與低濃度ADP刺激血小板聚集后易發生解聚有關。因此當以ADP為誘導劑時，PL-11檢測血小板聚集率應在2 h內完成檢測。我們發現膠原誘導的血小板聚集率在采血后4 h時較2 h時明顯降低，膠原為誘導劑的檢測也應于2 h內完成。這與之前關于標本放置時間對光比濁法的影響研究是一致的[9]。

本研究結果發現，PL-11在2 h時測健康組血小板聚集率高于治療患者組，證實阿司匹林與氯吡格雷對患者血小板功能抑制的實驗室監測有效性。服藥患者組中，AA誘導的血小板聚集率在2 h、4 h、8 h均無明顯差異，Col誘導的血小板聚集率在8 h時出現明顯降低，結果與健康組相似。ADP誘導的血小板聚集率在4 h時明顯降低，這與之前文獻有相似的結果[10]，該研究中以ADP為誘導劑，標本放置3 h時較采血后立即檢測降低近50%。我們的研究還發現，ADP為誘導劑時，4 h與8 h無明顯差異，且8 h時血小板聚集率明顯高于健康人組，可能是由于冠心病患者存在高血小板聚集率，即高血小板活化狀態下，盡管其已服用氯吡格雷抑制P2Y12受體，但在標本放置時間較長時仍有較正常人高的血小板聚集率。因此，該結果提示放置時間對服用抗血小板藥物患者檢測結果有影響，且似乎與健康人不同，可進一步驗證標本放置時間對服用抗血小板藥物狀態下健康人與冠心病患者的差異。

檢驗前處理對檢驗結果影響重大，尤其是住院患者，病房采血時間較早(一般在早晨5：00 -6：00)，標本送至實驗室檢測時已經過了實驗測定的規定時間，影響實驗結果。本研究結果提示，標本放置時間對PL-11血小板功能檢測存在影響，在檢測健康人或已服用抗血小板藥物治療的患者時，AA誘導血小板聚集受時間影響較小，但ADP與膠原誘導血小板聚集隨著標本放置時間延長，血小板聚集率降低。因此，PL-11檢測血小板功能時，AA誘導應在采血后4 h內完成，ADP和Col誘導應在采血后2 h內完成。

1 Guan J， Cong Y， Ren J， et al. Comparison between a new platelet count drop method PL-11， light transmission aggregometry，VerifyNow aspirin system and thromboelastography for monitoring short-term aspirin effects in healthy individuals［J］. Platelets，2014， 26（1）： 25-30.

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3 Duke WW. The relation of blood platelets to hemorrhagic disease. Description of a method for determining the bleeding time and the coagulation time and report of three cases of hemorrhagic disease relieved by transfusion［J］. JAMA， 1910， 55：1185-1192.

4 Massberg S， Brand K， Grüner S， et al. A critical role of platelet adhesion in the initiation of atherosclerotic lesion formation［J］. J Exp Med， 2002， 196（7）：887-896.

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9 陳興明，李祖蘭，劉香玲，等.血標本室溫放置時間對血小板聚集的影響［J］.現代檢驗醫學雜志，2013，28（6）：76-77.

10 Johnston LR， Larsen PD， La Flamme AC. Methodological considerations for the assessment of ADP induced platelet aggregation using the Multiplate （R） analyser［J］. Platelets， 2013， 24（4）：303-307.

Effects of sample storage time on platelet function tested with PL-11 analyzer

ZHU Yuan1, GUAN Jie2, TIAN Yueqiang1, LI Li1, PING Muye1, REN Junwei3, DENG Xinli1, CONG Yulong1
1Department of Clinical Laboratory in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Clinical Laboratory, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China;3Department of Clinical Laboratory, Beijing North Hospital of China North Industrise Group Corporation, Beijing 100089, China

CONG Yulong. Email: yulongc@263.net

ObjectiveTo identify the effects of storage time on platelet function tested with PL-11 analyzer under room temperature.MethodsCitrated antecubital vein blood samples of graduate students in grade 2012 of Chinese PLA Medical School (n=20) and coronary heart disease (CHD) outpatients (n=20) treated with dual-antiplatelet drugs in the department of cardiology were drawn and tested by PL-11 analyzer at 3 testing points: 2, 4 and 8 hours after blooding. The maximum platelet aggregation ratio was tested with 3 different activators: arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP) and collagen.ResultsHealthy young men: AA-induced platelet aggregation ratio showed no difference between 2 h, 4 h and 8 h (P＞0.05). When ADP used as the activator, platelet aggregation ratio reduced apparently at 4 h compared with 2 h (P＜0.01), and it reduced to 4.3% at 8 h (P＜0.01). There was a clear reduction of collagen-induced platelet aggregation at 4 h compared with 2 h (P＜0.01), while no difference was found between 4 h and 8 h (P＞0.05). Patients treated with dual-antiplatelet drugs: AA-induced results showed no statistic difference between 2 h, 4 h and 8 h (P＞0.05). ADP-induced results showed an obvious reduction at 4 h, while no difference was found between 4 h and 8 h (P＞0.05). Collagen-induced aggregation ratio reduced apparently at 8 h after blood sampling (P＜0.01).ConclusionStorage time affects the results of PL-11 platelet function test with limited influence on AA-induced platelet aggregation ratio, whatever in healthy men or patients treated with dual-antiplatelet drugs. ADP- or collagen-induced platelet aggregation ratio reduces as the time delay extending. The time delay between collection, transport and analysis should ideally be preferable in 4 hours when AA used as activator or 2 hours when ADP and collagen used as activators. Keywords: platelet aggregation; pre-analysis control; PL-11; storage time

R 446.1

A

2095-5227(2015)06-0611-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.06.024

時間：2015-03-24 10:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150324.1013.002.html

2015-02-09

朱遠，男，在讀碩士。Email: 3466591133@qq.com

叢玉隆，男，主任醫師，教授，博士生導師。Email: yu longc@263.net